Ćwiczenie 2
BUDOWA, WA
AŚCIWOŚCI I FUNKCJA BIAA
EK
Część doświadczalna obejmuje:
- ilościowe oznaczanie białek metodą biuretową
- wytrącanie kazeiny w punkcie izoelektrycznym
- frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu
- denaturacja białek (termiczna, etanolem o wy\
szym stę\
eniu, niektórymi kationami i anionami)
WPROWADZENIE
A
ączenie się aminokwasów wiązaniami amidowymi prowadzi do utworzenia liniowej makro-
cząsteczki  polipeptydu. A
ańcuchy polipeptydowe zawierające ponad 100 reszt aminokwasowych
przyjmuje się określać ju\
jako białka. Wiązanie amidowe, nazywane równie\
wiązaniem pep-
tydowym, powstaje z grupy ą-karboksylowej i grupy ą-aminowej. Na ryc. 1A przedstawiono di-
peptyd (seryloalaninę) utworzony z seryny i alaniny. Wiązanie peptydowe jest stabilizowane me-
zomerycznie, gdy\
wiązanie C-N ma częściowo charakter wiązania podwójnego C=N (Ryc.
1B). To usztywnienie wiązania peptydowego powoduje, \
e we wszystkich uło\
eniach przestrzen-
nych białek grupy amidowe pozostają płaskie. Swobodna rotacja jest mo\
liwa tylko wokół wią-
zania N-Cą i Cą-C, a obroty są opisywane przez wartości kątów torsyjnych � (fi) i � (psi) (Ryc.
� �
� �
� �
1A).
Ryc. 1. Właściwości wiązania amidowego (peptydowego) (Koolman, R�hm 2005)
1
Ryc. 2. Struktury drugorzędowe białek (ą-helisa, helisa kolagenu, pofałdowanej kartki, �-pętla)
(Koolman, R�hm 2005)
2
Konformacja łańcucha peptydowego utworzona przez kilka kolejnych reszt aminokwasowych
definiuje strukturę drugorzędową stabilizowaną wiązaniami wodorowymi (Ryc. 2).
Białka, ze względu na skład, dzieli się na białka proste i zło\
one. Białka proste zbudowane są
tylko z aminokwasów, natomiast białka zło\
one zawierają szereg ró\
nych komponentów nieami-
nokwasowych, których rodzaj staje się podstawą podziału białek na:
- glikoproteiny - białka zawierające cukry obojętne (galaktoza, mannoza, fukoza), aminocukry
(N-acetyloglukozamina, N-acetylogalaktozamina) lub kwasy pochodne mono-
sacharydów (kwas uronowy, kwas sjalowy)
- lipoproteiny  zawierają fosfolipidy, cholesterol i inne związki lipidowe
- metaloproteiny  zawierają jony metali związane jonowo lub koordynacyjnie
- fosfoproteiny  reszty tyrozyny, treoniny lub seryny są zestryfikowane kwasem fosforowym
- nukleoproteiny  zawierają RNA lub DNA
- chromoproteiny  zawierają grupę prostetyczną, którą stanowią ró\
ne związki barwne
Na ryc. 3 pokazano potencjalne miejsca modyfikacji łańcucha polipeptydowego. Modyfika-
cjom ulegają zwykle polarne reszty aminokwasów, stanowiąc wa\
ne z
ródło ró\
norodności białek.
Ryc. 3. Potranslacyjne modyfikacje łańcucha polipeptydowego (Koolman, R�hm 2005)
3
Białka ze względu na pełnione funkcje mo\
na podzielić na:
- enzymatyczne  najliczniejsza grupa białek (ponad 2000) o zró\
nicowanej masie cząsteczkowej
- strukturalne  są odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek (kolagen, ela-
styna, tubulina, aktyna, ą-keratyna). Do białek strukturalnych zalicza się tak-
ą
ą
ą
\
e histony pełniące kluczową rolę w upakowaniu DNA w chromatynie
- transportujące  np. hemoglobina uczestniczy w transporcie tlenu i CO2 Niektóre białka oso-
cza (prealbumina) transportujące hormony, transferyna przenosząca \
elazo,
niektóre białka błonowe np. kanały jonowe pośredniczące w transporcie jonów,
nośniki w transporcie metabolitów i jonów, pompy funkcjonujące w transpor-
cie aktywnym jonów i metabolitów
- regulacyjne  białkami są niektóre hormony (somatotropina, insulina), a tak\
e receptory
uczestniczące w percepcji ró\
nych cząsteczek sygnałowych. Białkami regulato-
rowymi są tak\
e czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję genów
- odpornościowe  białka układu immunologicznego (np. immunoglobuliny) chronią organizm
przed czynnikami chorobotwórczymi i ksenobiotykami (substancjami obcymi
dla organizmu)
- motoryczne  uczestniczą w procesach związanych z ruchem (aktyna, miozyna); kinezyna
funkcjonuje w przemieszczaniu organelli w komórce
- zapasowe  owoalbumina w białku jaja stanowi z
ródło aminokwasów dla rozwijającego się za-
rodka; ferrytyna wią\
e \
elazo w wątrobie, kazeina jest białkiem zapasowym
mleka, niektóre białka budujące mięśnie mogą być wykorzystywane jako mate-
riał energetyczny; tak\
e wiele białek roślinnych pełni funkcję zapasową
Ze względu na rozpuszczalność i kształt, białka dzielą się na: globularne (kuliste) i fibrylarne
(włókienkowate, skleroproteiny).
Do białek fibrylarnych nale\
ą: ą-keratyny włosów, wełny, piór, paznokci, kolageny zawarte
głównie w tkance łącznej, elastyny, fibroina jedwabiu.
Białka globularne obejmują:
-białka obojętne (albuminy, globuliny)
-kwaśne (prolaminy, gluteiny)
-zasadowe (histony, protaminy)
Na ryc. 4 przedstawiono półschematycznie, w około 1,5-milionowym powiększeniu, struktury
kilku wewnątrz- i pozakomórkowych białek.
4
Ryc. 4. Strukturalne i funkcjonalne zró\
nicowanie białek (półschematyczne struktury w około 1,5
mln powiększeniu; długość kolagenu w tym powiększeniu wynosi około 30 cm) (Koolman, R�hm
2005)
5
Rozpuszczalność białek globularnych
Cząsteczki białka są amfoterami tworzącymi w roztworach wodnych koloidy. Fazę rozproszo-
ną stanowią cząsteczki białka o wymiarach 5-100 nm i masach cząsteczkowych sięgających nawet
miliona Daltonów (Da). Większość białek wykazuje du\
e powinowactwo do wody. Takie koloidy
nazywamy hydrofilowymi.
Białka, podobnie jak aminokwasy, posiadają ładunek, lecz w pH równym punktowi izoelek-
trycznemu (pI) są elektrycznie obojętne (Rys. 5). Ró\
ne białka mają ró\
ne wartości punktu izo-
elektrycznego. W pH powy\
ej i poni\
ej pI białka mają ładunek odpowiednio ujemny i dodatni, w
wyniku czego białko zostaje otoczone dipolami wody (hydratacja). Zjawisko to warunkuje roz-
puszczalność w wodzie tak du\
ych cząsteczek jak białka. Pozbawienie białek ładunku powoduje
dezintegrację otoczki wodnej i utratę rozpuszczalności. Białka ró\
niące się wartościami punktu
izoelektrycznego w tym samym pH środowiska będą posiadały ró\
ny ładunek i ró\
ne powinowac-
two do wody, co umo\
liwia ich frakcjonowanie i rozdział.
Ryc. 5. Udział ładunku elektrycznego w procesach wytrącania białka w roztworze
Z powy\
szego wynika, \
e wytrącanie białka zachodzi najłatwiej w punkcie izoelektrycz-
nym. Jeśli proces ten będzie przebiegał w niskiej temperaturze (0-50 C), to uzyskane w osadzie
białko, po rozpuszczeniu zachowa cechy charakterystyczne dla białka natywnego.
Na ryc. 6 pokazana jest zale\
ność rozpuszczalności białka od pH w warunkach zró\
nicowa-
nego stę\
enia NaCl. Rozpuszczalność białka wyraz
nie maleje w pH zbli\
onym do pI. Największy
spadek rozpuszczalności obserwuje się w warunkach niskiego stę\
enia soli (1 mM NaCl).
6
Ryc. 6. Wpływ pH i niewielkich stę\
eń NaCl na rozpuszczalność �-laktoglobuliny w 250 C
(Lehninger 1979)
Wpływ stę\
enia soli na rozpuszczalność białek
Rozpuszczalność jest funkcją zarówno stę\
enia soli obojętnej, jak te\
ilości ładunków wszyst-
kich rodzajów jonów znajdujących się w roztworze. Wartości te określają siłę jonową roztworu: �
= 1/2Łcizi2 (c  stę\
enie jonów; z  ładunek jonów)
Ryc. 7. Zasalanie (wsalanie) i wytrącanie białek (wysalanie) w warunkach rosnącej siły jonowej
roztworu (Koolman, R�hm 2005)
7
Rozpuszczalność białka w wodzie destylowanej jest bardzo mała, natomiast rośnie wraz ze
wzrostem siły jonowej, gdy\
rośnie liczba jonów nieorganicznych na powierzchni białka zapobie-
gających ich agregacji. Zjawisko to nazywa się wsalaniem lub zasalaniem (Ryc. 7). Przy odpo-
wiednio du\
ej sile jonowej, sól odciąga cząsteczki wody od powierzchni białek i doprowadza do
ich agregacji (wysalanie białka) (Ryc. 7). Białko(a) wysolone rozpuszcza się ponownie po usu-
nięciu soli lub po rozcieńczeniu roztworu.
Zdolność wysalająca soli zale\
y zarówno od charakteru kationu, jak i anionu. Ze względu na
siłę wysalającą mo\
na uszeregować kationy i aniony w następujący sposób:
Aniony: cytrynian3- > winian2-> siarczan2- > octan- > chlorek- > azotan- > rodanek-
Kationy: Th3+ > Al2+ > Se2+ > Sr2+ > Ca2+ > Mg2+ > NH4+ > Na+ > Li+
Szeregi te noszą nazwę szeregów liotropowych lub szeregów Hofmeistera.
Rozpuszczalność białek jest tak\
e funkcją stałej dielektrycznej środowiska, gdy\
w warun-
kach nie zmieniającego się pH i siły jonowej maleje po dodaniu rozpuszczalników o niskiej
stałej dielektrycznej takich jak: etanol, aceton, glikol etylenowy. Białka w takich warunkach
agregują, gdy\
dodany rozpuszczalnik zmniejsza stopień uwodnienia grup jonowych przez
zmniejszenie ilości dipoli wodnych na powierzchni cząsteczki białka. Obni\
enie stałej dielek-
trycznej roztworu przez dodanie rozpuszczalnika powoduje wzrost siły przyciągania pomiędzy
przeciwnie naładowanymi grupami.
Rozpuszczalność większości białek zwiększa się w ograniczonym zakresie (0  400 C) wraz ze
wzrostem temperatury. W temperaturze powy\
ej 40-500 C większość białek zaczyna tracić trwa-
łość i ulega denaturacji. Białka mogą tak\
e denaturować w szczególnie drastycznych warunkach tj.
skrajne pH, wysoka temperatura, promieniowanie jonizujące. Denaturacja pociąga trwałą utratę
funkcji biologicznych i wią\
e się ze zmianami w strukturze drugo-, trzecio- i czwartorzędo-
wej białka.
8
WYKONANIE
Kolorymetryczne oznaczanie białek metodą biuretową
Zasada metody:
Metoda polega na oznaczaniu natę\
enia barwy powstałej w wyniku wytworzenia związków
kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym, z maksimum absorbancji
przy  = 540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczby wiązań
peptydowych. Zale\
ność ta jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania białek. Czułość me-
tody - 0,1 mg/ml.
Nazwa reakcji pochodzi od biuretu - związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch cząste-
czek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe
Metoda biuretowa nie nadaje się do oznaczania białek w obecności soli amonowych, gdy\
jon
amonu daje równie\
barwne kompleksy z jonami miedzi (II). W reakcji przeszkadza tak\
e siarczan
(VI) magnezu, poniewa\
wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu
maskuje właściwy odczyn.
9
Odczynniki:
- standardowy roztwór albuminy - 10 mg/ml w 0,9% NaCl
- odczynnik biuretowy: 1,5 g 5hydratu CuSO4 i 6,0 g winianu sodu i potasu rozpuścić w 500 ml
wody dest. w kolbie miarowej na 1000 ml. Następnie małymi porcjami stale mieszając dodać 300
ml 10% NaOH i uzupełnić objętość wodą dest. do 1 l. Dodać 2g KJ. Odczynnik jest stabilny.
Wykonanie krzywej standardowej i oznaczenie stę\
enia białek w surowicy krwi
Do suchych probówek odmierz pipetą kolejno podane w tabeli objętości standardowego roz-
tworu albuminy, wody i odczynnika biuretowego. Ka\
dą próbę wykonaj w dwóch powtórzeniach.
Nr próby
1 2 3 4 5 6
Stę\
enie albuminy (mg/próbę)
1 2 3 4 5 0
Roztwór standardowy (ml)
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0
Woda destylowana (ml)
0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,5
Odczynnik biuretowy (ml)
2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
A1
A540nm A2
Aśr
K = mg albuminy w próbie
A540 nm
Równocześnie oznacz zawartość białka w 10-krotnie rozcieńczonej surowicy krwi (do oznaczeń
pobierz 0,5 i 0,1 ml; w tym drugim przypadku próbę uzupełnij wodą do 0,5 ml). Po upływie 30
min zmierz absorbancję prób przy długości fali  = 540 nm w 1 cm kuwetach. Pomiaru dokonaj
względem próby zerowej nie zawierającej białka (próba 6). Zapisz wyniki w tabeli. Oblicz współ-
czynnik kierunkowy K. Narysuj krzywą wzorcową (zale\
ność wartości absorbancji od stę\
enia
białka w próbie). Przy obliczaniu ilości białka w próbie stosuj obliczony współczynnik K. Z ozna-
czonej w próbie zawartości białka oblicz stę\
enie białka w surowicy.
10
Wytrącanie i denaturacja białek
Wytrącanie białek
Wytrącanie białek w punkcie izoelektrycznym
Do 1 ml 0,1% roztworu kazeiny, rozpuszczonej w 50 mM roztworze octanu sodu, dodawać
bardzo powoli pipetą Pasteura, cały czas delikatnie wytrząsając, około 1,5 ml 0,5 M roztworu
kwasu octowego. Obserwować pojawianie się zmętnienia pochodzącego od wytrącającego się
białka, które powinno rosnąć z upływem czasu. Po 5 min dodać porcjami jeszcze około 1,5 ml
0,5 M roztworu kwasu octowego i obserwować czy wytrącona w pI kazeina rozpuszcza się po ob-
ni\
eniu pH roztworu (wartość pI kazeiny wynosi 4,7)
Frakcjonowanie białek surowicy krwi metodą wysalania siarczanem amonu
Do wysalania białek stosujemy najczęściej związki o wysokim powinowactwie do wody tj.
siarczan (VI) amonu lub siarczan (VI) sodu.
Ćwiczenie wykonujemy w probówkach wirówkowych. Do 2 ml surowicy (10-krotnie roz-
cieńczonej 0,9% roztworem NaCl) dodać 2 ml nasyconego roztworu (NH4)2 SO4. Po zmieszaniu
roztworów uzyskuje się półnasycenie (50% nasycenie) siarczanu (VI) amonu. Agregujące globuli-
ny odwirować w wirówce stołowej, a następnie zlać klarowny supernatant do suchej probówki
wirówkowej. Do osadu globulin dodać niewielką ilość wody destylowanej do całkowitego roz-
puszczenia białek. Do przelanego supernatantu dodawać, cały czas wytrząsając, kryształki
(NH4)2SO4, tak by uzyskać roztwór nasycony (kryształki siarczanu amonu przestają się rozpusz-
czać). Wzrost siły jonowej roztworu powoduje wytrącanie się frakcji albumin.
Wytrącanie białek surowicy krwi etanolem
Do 0,5 ml surowicy 10x rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl i oziębionej w lodzie dodać 1 ml
96% etanolu. Powstaje zmętnienie, które znika po natychmiastowym rozcieńczeniu 0,9% NaCl lub
wodą.
Denaturacja białek
Termin ten dotyczy wszystkich zmian w strukturze cząsteczki białka, w wyniku których białko
traci swoje biologiczne właściwości. Denaturacja następuje wówczas, gdy pod wpływem czynni-
ków fizycznych lub chemicznych ulega zniszczeniu struktura IV-, III- lub II-rzędowa.
11
Denaturacja cieplna białek
2 ml 1% roztworu albuminy lub 1% roztworu białka jaja kurzego ogrzać do zagotowania. Two-
rzy się biały osad wytrąconego białka.
Denaturacja białek etanolem
Rozpuszczalniki organiczne (etanol, aceton, eter) i detergenty działają na strukturę przestrzen-
ną cząsteczki białka, osłabiając wiązanie hydrofobowe, reagują bezpośrednio z naładowanymi
grupami na powierzchni cząsteczki i dezorganizują płaszcz wodny cząsteczki. Działanie denatu-
rujące etanolu objawia się dopiero przy większych jego stę\
eniach, po dłu\
szym czasie dzia-
łania i w wy\
szej temperaturze (200- 300 C).
Do probówki dodać 1 ml 1% albuminy i 1 ml 96% etanolu. Po godzinie rozcieńczyć zawartość
probówki wodą. Osad nie rozpuszcza się. Porównaj z ćwiczeniem, w którym białka były wytrą-
cane etanolem.
Strącanie białek za pomocą kationów
Białka w pH wy\
szym od pI posiadają ładunek ujemny i mogą reagować z kationami. Kationy
metali alkalicznych dają sole dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, natomiast kationy me-
tali cię\
kich (Fe2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+, Ag+) tworzą sole nierozpuszczalne.
Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodać parę kropel 1% roztworu FeCl3. Wytrąca się osad
białczanu \
elaza (III). Wykonać analogiczną próbę z HgCl2, Pb(CH3COO)2 oraz AgNO3.
Strącanie białek kwasem sulfosalicylowym i trójchlorooctowym
COOH
Cl
OH
C
Cl
COOH
HO3S
Cl
Kwas sulfosalicylowy Kwas trójchlorooctowy
Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodać 0,5 ml 10% roztworu kwasu trójchlorooctowego.
Końcowe stę\
enie kwasu niezbędne do odbiałczania nie powinno być ni\
sze ni\
5%.
Do 0,5 ml 1% roztworu albuminy dodać kilka kropel 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego.
12
Zagadnienia do przygotowania:
- budowa i właściwości wiązania amidowego (peptydowego)
- struktury drugorzędowe białek (wiązania stabilizujące strukturę)
-wiązania stabilizujące III- i IV- rzędową strukturę białek
- białka proste i zło\
one; przykłady potranslacyjnej modyfikacji łańcuchów bocznych
aminokwasów
-podział białek ze względu na funkcję (przykłady)
- kolorymetria (zasada ilościowego oznaczania białek metodą biuretową)
-właściwości białek w roztworze (zale\
ność rozpuszczalności białek od pH, siły jonowej, stałej
dielektrycznej rozpuszczalnika, temperatury)
-zasada wytrącania białek w pI, wytrącania przez wysalanie lub obni\
enie stałej dielektrycznej
roztworu
- denaturacją białek (termiczna, wy\
sze stę\
enie etanolu, kationy metali cię\
kich, niektóre kwasy
organiczne)
Piśmiennictwo:
Biochemia  JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Biochemia  AL. Lehninger PWR i L, Warszawa, 1979
Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik  J Koolman, K-H R�hm, PZWL, Warszawa 2005
13