Należy pracować w rękawiczkach:
możliwość zakażenia i zatrucia substancjami badanymi lub
używanymi odczynnikami (toksyny, bakterie, substancje
radioaktywne)
możliwość zakażenia badanych materiałów przez osoby
pracujÄ…ce w laboratorium
Preparaty biochemiczne są nietrwałe możliwość
namnażania bakterii
roztwory należy sterylizować
materiał biologiczny i roztwory przechowujemy w chłodni lub
mrozimy
naczynia powinny być jednorazowe lub sterylizowane
Analiza chemiczna
" Jakościowa  określenie składu badanej substancji
" Reakcje charakterystyczne dla danego zwiÄ…zku
" Ilościowa  określenie ilości badanej substancji
Stężenia
" mol/litr - M
" mikromol/litr - uM
" gram/litr  g/l
" miligram/mililitr  mg/ml
" C % = (masa substancji rozpuszczonej/masa roztworu) * 100%
Dysocjacja elektrolityczna
" NaCl Na+ + Cl-
" H2O + H2O H3O+ + OH-
Moc jonowa
1
µ = ci zi2
"
2
i
gdzie: ci, zi - stężenie i ładunek jonu i,
Metody analityczne
Pierwszym etapem jest rozdział
" Badaną substancje można wydzielić przez:
" Zmiana mocy jonowej
" Wysolenie siarczanem amonu (dodatek rzędu
10-100% nasycenia ((NH4)2SO4
" Denaturacja - ogrzewanie lub dodanie czynnika
denaturujÄ…cego
" Filtracja lub wirowanie
" Chromatografia
" Elektroforeza
Chromatografia
" Polega na przepuszczaniu przez kolumnÄ™ roztworu
białek. Kolumna jest to rura wypełniona złożem
mającym taką właściwość że substancje w trakcie
przepływu przez nią cieczy migrują z różną
szybkością. Zbierając frakcje o określonej objętości
dokonujemy rozdziału. Najpierw zbieramy substancje
szybko migrujące przez kolumnę a na końcu te
najwolniej migrujÄ…ce
Kolumna chromatograficzna
Elektroforeza
Aparat do elektroforezy
Żel po elektroforezie
Fragment żelu poliakrylamidowego analizowanego w świetle UV.
Elektroforeza przebiegała od góry ku dołowi.
Analiza ilościowa i jakościowa
" Metody ilościowe
" Analiza wagowa
" Miareczkowanie
" Spektrofotometria
" Metody elektrochemiczne, np. elektrody jonoselektywne
" Metody Jakościowe
" Reakcje charakterystyczne
"
" Obecnie podstawowe metody analityczne zwiÄ…zane sÄ… ze
spektrofotometria
" Spektrofotometria polega na pomiarze pochłaniania światła
przez rozpuszczonÄ… substancje.
Promieniowanie
elektromagnetyczne
1- 1000 m radiowe
380 - 450 nm Fiolet
106  108 nm mikrofale
575 - 585 nm żółty
750 - 106 nm podczerwień
450 - 500 nm Niebieski
400 -750 nm widzialne
585 - 620 nm
10- 400 nm nadfiolet
Pomaranczowy
10-3  10-1 nm rentgenowskie
500 - 575 nm Zielony
620 - 780 nm Czerwony
" Światło ma charakter korpuskularno falowy co
oznacza ze zachowuje siÄ™ jak fale ale zarazem jak
czÄ…stki energii.
" Cząsteczki chemiczne maja ściśle określone poziomy
energetyczne i mogą pochłaniać kwanty światła
ściśle odpowiadające różnicom między tymi
poziomami energetycznymi. Wynika z tego że dana
substancja pochłania światło w bardzo specyficzny
sposób,
" Jeśli naświetlimy barwny roztwór białym światłem zawierającym
wszystkie kolory, to zaobserwujemy ze część światła została
pochłonięta co powoduje zmianę barwy światła po przejściu
przez badany roztwór.
" Roztwory miedzi maja kolor niebieski kobaltu różowy a niklu
zielony.
" Różne substancje pochłaniają światło przy różnych długościach
fali,
" alkohol etylowy pochłania fale świetlne w zakresie
podczerwieni, zjawisko to wykorzystuje się miernikach stężenia
alkoholu w wydychanym powietrzu
" Białka i nukleotydy (ATP, kwasy nukleinowe) pochłaniają fale
świetlne w zakresie UV nadfioletu
Spektrofotometria
" Są różne metody spektrofotometryczne, różniące się metodą
pomiaru jak i długością fali przy której dokonujemy pomiarów.
" Można mierzyć bezpośrednio badaną substancje na przykład
roztwory białek przy długości fali 280 nm lub też kompleksy
barwne na przykład oznaczenia fosforanów metodą fiske
subarowa lub białek przeprowadzając reakcje barwną z
biuretem a nastepnie oznaczając stężenie tworzącego się
barwnego kompleksu
" Można zbudować przyrząd , spektrofotometr wytwarzający
światło monochromatyczne o jednej barwie , jednej długości
fali a następnie zmieniać długość fali wytwarzanego światła.
" Jeśli takie światło przepuścimy przez badaną substancje i
będziemy rejestrować zmiany pochłaniania tego światła w
zależności od długości fali to otrzymamy widmo absorpcyjne
danej substancji.
" Ponieważ wiadomo jak związki chemiczne absorbują światło
to z takiego widma można zorientować się co zawiera badana
próbka. Białka absorbują w nadfiolecie przy długości fali ok. 280
nm (UV) a kwasy nukleinowe przy 260 nm (UV). Takie widma
pozwalają określić skład i stężenie zawartych w roztworze
substancji.
Spektrofotometr
Widmo absorpcyjne
Widmo jest to graficzny zapis zmian wartości absorbancji w zależności od długości fali
przechodzącej przez badany roztwór. Głównymi parametrami widma są:
a - położenie pasm (wartość długości fali przy których na widmie można wyróżnić
maksima; lmax)
b - molowy (lub właściwy) współczynnik absorpcji związany z danym maksimum.
Absorpcja promieniowania przez roztwór
Transmitancja i absorbancja
Jeśli badany roztwór pochłonie 90% promieniowania o danej długości fali, to
powiemy, że jego transmitancja wynosi 10%, zaś absorbancja będzie
wynosić lg(100/10)=1
Prawo Lamberta Beera
A = e·c·l
c =A/(e*l)
Ponieważ l = 1cm można zapisać c =A/e
e - molowy współczynnik absorpcji, równy liczbowo absorbancji, która wystąpiłaby,
gdybyśmy mierzyli w danych warunkach roztwór o stężeniu 1 mol/dm3 przy grubości
warstwy równej 1 cm;
c - stężenie mierzonego roztworu w mol/dm3;
l - grubość warstwy roztworu w cm.
Prawo Lamberta Beera
A = e·c·l
c =A/(e*l)
Ponieważ l = 1cm można zapisać c =A/e
e - molowy współczynnik absorpcji, równy liczbowo absorbancji, która
wystąpiłaby, gdybyśmy mierzyli w danych warunkach roztwór o
stężeniu 1 mol/dm3 przy grubości warstwy równej 1 cm;
c - stężenie mierzonego roztworu w mol/dm3;
l - grubość warstwy roztworu w cm.
" Najczęściej używa się wspólczynnika absorpcji
wyrażonego w jednostkach w jakich wyrażamy stężenia
badanych substancji. Dla białek są to mg/ml a nie mol/dm3
Prawo addytywności absorpcji
" Absorpcja roztworu wieloskładnikowego równa się
sumie absorbancji poszczególnych składników:
"
A = A1 + A2 + & An
" Gdzie: A1, A2, & , An sÄ… to absorbancje
poszczególnych składników.
Pomiary spektrofotometryczne
" Najczęściej pomiary prowadzi się w kuwetach pomiarowych o
długości drogi optycznej 1 cm, często kuwety nie są
symetryczne i należy wkładać je do spektrofotometru we
właściwy sposób
" Kuwety muszą być wykonane z materiału nie pochłaniającego
promieniowania w zakresie długości fali przy których
dokonujemy pomiaru.
" Dla nadfioletu (UV) używamy tylko kuwet kwarcowych
oznaczonych literÄ… Q, kuwety plastikowe lub szklane
pochłaniają promieniowanie co uniemożliwiłoby pomiary.
Pomiary spektrofotometryczne
" Najprościej byłoby zmierzyć absorpcje podzielić przez
współczynnik absorpcji i odczytać stężenie. W praktyce jest to
niemożliwe bo roztwory pochłaniają światło w niespecyficzny
sposób na skutek zmętnienia co więcej zawierają
zanieczyszczenia np. ATP zwiÄ…zek chemiczny bardzo mocno
pochłaniający promieniowanie w zakresie nadfioletu (UV)
" Posługujemy się zmodyfikowanym wzorem do oznaczania
stężenia
Abs(specyficzna)  Abs (niespecyficzna)
" C= ---------------------------------------
" współczynnik absorbcji
Pomiary spektrofotometryczne
" Często oznaczamy nie bezpośrednio daną substancje a
powstajÄ…cy w reakcji z niÄ… barwny zwiÄ…zek w takich wypadkach
należy zastosować krzywą wzorcową gdyż reakcja barwna
może zachodzić w różnym stopniu (odczynniki się starzeją)
" Przygotowujemy roztwór jak najbardziej zbliżony do roztworu
badanego a następnie przygotowujemy kilka próbek
zawierajÄ…cych mierzonÄ… substancje o wzrastajÄ…cych
stężeniach. dodajemy mierzoną substancje po zmierzeniu
absorpcji rysujemy zależność absorpcji od stężenia i
otrzymujemy krzywÄ… wzorcowÄ….
Krzywe wzorcowe
" Roztwory wzorcowe powinny mieć podobny skład do
próbki
" Krzywa wzorcowa powinna składać się co najmniej z
czterech punktów
" Stężenia roztworów wzorcowych powinny być
zbliżone do stężenia badanej próbki
Krzywa wzorcowa