TVM
Rodzaj Carlavirus
Cząstki nitkowate , lekko powyginane o długości 610-700 nm i średnicy 12-15 nm
Objawy od słabych do ostrych zależe m.in od odmiany pomidora , mozaiki, zahamowanie wzrostu.
Mieści się w nich pojedyńcza nić sensownego RNA o długości 7,4-7,7 kb
Zakres naturalnych żywicieli jest ograniczony
przenoszą się przez mszyce Myzus persicae, Aphis frangulae, A. nasturtii, Macrosiphum euphorbiae
nie przenoszony przez kanianke
TVX
Rodzaj: Poteoxvirus
cząstki nitkowate, lekko powyginane o długości 515 nm i średnicy 13nm
kanał centralny ma średnicę 3 nm
genom to (+)ssRNA o długości 5,9-7,0 kb
wywołują objawy zbliżone do mozaiki (łagodne mozaiki), straty w plonie od 10-20%, na tytoniu powoduje nekrozy lub nekrotyczne plamy ,u pomidora powoduje mozaike oraz nieznaczne zachamowanie.
przenoszone mechanicznie, również przez grzyb Synchytium endobioticum, koniki polne Tettigonia viridissima i Melanoplus differentialis
przenoszony przez kanianke
silnie immunogeny co za tym idzie rozpoznawalny droga badań serologicznych
punkt izoelektryczny pH 4,4
spektrofotometria A260 nm(0.1%, 1 cm): 2.97 (Paul, 1959). A260/A280: 1.20 (
mobilnosć elektroforetyczna -4 x 10-6 cm2 s-1 V-1
atakuje 240 gatunków roślin z 16 rodzin, głównie z Solanaceae
Objawy wirusa X (PVX) podobnie jak wirusa PVM, najbardziej ujawniają się przy prowadzeniu roślin w warunkach obniżonej temperatury i słabszego oświetlenia. Typowym symptomem porażenia wirusem PVX jest łagodna mozaika międzynerwowa.
Jednoczesne występowanie wirusów PVX i PVM w roślinie może wywołać ostrą mozaikę, która rodzajem objawów zbliżona jest do objawów powodowanych wirusem PVY.
1. Test „ELISA”
Test ELISA jest wiarygodną i czułą metodą wykrywania wirusów roślinnych . Pomimo, że test opracowano ponad 30 lat temu, w diagnostyce rutynowej jest nadal powszechnie stosowany, z uwagi na lepszą przydatność do masowego testowania prób, niż bardziej czułe metody molekularne. W literaturze opisywano możliwość powtórnego stosowania mikropłytek po odmyciu kompleksów immunologicznych ze studzienek za pomocą roztworów o niskim pH (Bar-Joseph i wsp. 1979). Podczas testowania mycia proszkiem do prania w celu umożliwienia recyklingu mikropłytek zaobserwowano, że takie traktowanie poprawia czułość testu ELISA.
2. Testy uzupełniające
1) zmodyfikowany test mikroprecypitacji van Slogterena
Sposób wykonania testu
Za pomocą testów serologicznych może być wykrywane porażenie wirusami PVY, PVX, PVS i PVM. Badania serologiczne przeprowadza się na roślinach po 4 - 6 tygodniach od pełni wschodów. Najwłaściwszym kryterium terminu badań serologicznych jest stadium 6-7 liści. Najwyższa koncentracja wirusów występuje w pierwszych całkowicie rozwiniętych liściach, licząc od wierzchołka rośliny. Użycie soku z liści roślin starszych niż 6 tygodni zwiększa odsetek reakcji niespecyficznych. Rośliny w okresie co najmniej 3 dni przed pobraniem liści powinny rosnąć w temperaturze 18 -22oC, celem zwiększenia koncentracji wirusów w soku.
Sok z liści umieszcza się w próbówkach i rozcieńcza fizjologicznym roztworem NaCl w stosunku 1:1. W przypadku badania liści z pola, wskazane jest wyższe rozcieńczenie soku, a mianowicie: 1:1,5 - 2. Rozcieńczenie zmniejsza nasilenie reakcji niespecyficznych oraz ułatwia wirowania. Dodatek azydku sodu do fizjologicznego roztworu NaCl w ilości 0,5; 1,0g/l wpływa bardzo korzystnie na zmniejszenie ilości reakcji niespecyficznych oraz umożliwia inkubację przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Rozcieńczony sok z liści poddaje się działaniu temperatury - 10oC przez okres 15 minut i następnie wirowaniu przez 12 - 15 minut przy 5.000 obr/min. Odwirowany sok nanosi się pipetami na uprzednio nakropione surowice na szalkach Petri'ego. Szalki w celu zapobieżenia rozpływaniu się kropel powleka się hydrofobowym filmem uzyskanym za pomocą Mowitalu rozpuszczonego w chloroformie /1% roztwór/. Bardzo ważne dla właściwego przebiegu reakcji jest zachowanie odpowiedniej proporcji między wielkością kropli surowicy i soku. Kropla odwirowanego soku powinna być tylokrotnie większa od kropli surowicy, ilokrotne było rozcieńczenie soku przed wirowaniem. Po nakropieniu, szalkę zalewa się bezbarwnym olejem parafinowym, aby zapobiec wysychaniu kropel. Na jednej szalce o średnicy 12cm można badać 10 roślin jednocześnie na obecność 4 wirusów. Inkubację przeprowadza się w szafach chłodniczych w temperaturze 10-12oC przez okres 18-24 godzin.
W przypadku stosowania azydku sodu jako dodatku do roztworu NaCl, istnieje możliwość inkubowania w temperaturze pokojowej. Jednakże podczas badań serologicznych roślin starszych niż 6 tygodni oraz w okresach wysokich temperatur podczas wzrostu roślin, mimo stosowania azydku sodu, wskazana jest inkubacja w szafach chłodniczych. Odczytu dokonuje się pod mikroskopem stereoskopowym na ciemnym tle przy 25 - krotnym powiększeniu i oświetleniu bocznym. W zależności od koncentracji wirusa w roślinie najsilniejsze reakcji serologiczne obserwuje się przy obecności wirusa X.
Po nakropieniu, do czasu ostatecznej oceny mikroskopowej, fiolki z resztką soku przechowuje się w lodówce, gdyż w razie występowania reakcji niespecyficznych oraz ewentualnych błędów.
2) Testy biologiczne
W masowej ocenie zdrowotności prób ziemniaka, testy biologiczne w ostatnich latach nie znajdują praktycznego zastosowania.
Testy biologiczne ze względu na swoją czułość, są w dużym stopniu przydatne w badaniach podstawowych oraz w pracach hodowlanych, przy określeniu porażeń pierwotnych i rodzaju odporności odmian i rodów. W tym celu do identyfikacji poszczególnych wirusów służą głównie następujące rośliny testowe:
wirus X (PVX) - Datura stramonium, Gomphrena globosa, tytoń odmian Samsun i White Burley,
wirus M (PVM) - Solanum rostratum, fasola odm. Red Kidney, Licopersicon chilense,
3. Pasażowanie przez plamki lokalne.
4. różnice w sposobie przenoszenia wirusów.
Wirus TVX:
przenoszony przez kanianke
przenoszone mechanicznie, również przez grzyb Synchytium endobioticum, koniki polne Tettigonia viridissima i Melanoplus differentialis
Wirus TVM
przenoszą się przez mszyce Myzus persicae, Aphis frangulae, A. nasturtii, Macrosiphum euphorbiae
nie przenoszony przez kanianke
5.róznice w wrazliwosci wirusów na temperaturę:
Wirus TVX: inaktywacja 68-74 stopni Celcjusza
Wirus TVM: inaktywacja w 65-71 stopni Celcjusza
7.Elektroforeza:
8.hybrydyzacja zasadą molekularną:
Bibliografia
1. Witkowska Barbara WSTĘP DO ZASAD I METOD OCENY MATERIAŁU SIEWNEGO,Główny Inspektorat Inspekcji Nasiennej w Warszawie
2. TREDER KRZYSZTOF, PRZEWODOWSKI WŁODZIMIERZ
Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (4) 2009
POPRAWA CZUŁOŚCI WYKRYWANIA
WIRUSÓW ZIEMNIAKA TESTEM ELISA
DZIĘKI ZWIĘKSZENIU ADSORPCYJNOŚCI MIKROPŁYTEK
POPRZEZ MYCIE W PROSZKU DO PRANIA
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie
Zakład Nasiennictwa i Ochrony Ziemniaka w Boninie
Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Biochemii
3. Kryczyński S. Zasady identyfikacji i klasyfikacji wirusów roślinnych.