AGROBIOTECHNOLOGIE

Biotechnologia - integracja nauk przyrodniczych i izn w celu zstosowan organizmow, kom lub ich czesci oraz molekularnych analogow w celu pozyskiwania produktow i usług (Europ federacja biotechnologii) II - zastosowanie podstaw naukowych , inz do przetwarzania matarialow czynnikow biotechnologicznych w cel pozyskiwania dobr usług III - spos tworzenia okrslonych prod przez wykorzystanie procesow biologicznych.

Markery DNA:

1 ocena zmienności gen

2. identyfikacja genetyczna

3 mapowanie genow

4 marker (MAS)

Kultury tkankowe in vitro

1. mikrorozmnaz in vitro

- z pakow kwiatkowych na pożywkach z cytokinina

- organogeneza via kalus

2 kultura niedojrzałych zarodkow mieszkaniowych

3 haploidyzacja

Wykorzystanie technik kultur in vitro do realizacji gen-hod

Mieszance - kult. Merystemow, kalusa, kom, protoplastow

Rekombinacje- segregacje, transom obcego DNA, mieszance płciowe, somatyczne, haploidy

Wykorzystanie technik kultur in vitro do realizacji celow gen-hod

Utrzymywanie zmienności gen:

- kul merystemow, pedy przybyszowe,- k. kalusa- k. Komorek,- k. protoplastow

Roślinne kultury tkankowe in vitro- hodowla roślin, czesci rslin, tk lub poj kom na sztucznych pożywkach w sterylnych war.

TOTIPOTENCJA - zdol do odtwarz poszczeg organow a nawet calej rośliny z poj kom. Gdy kom te odlaczy się od opływu całego org, zwarta w niej inf gen może zostac uruchomiona i wykorzystana w okresl sposób.

Klonowanie roślin- rozmnazanie wegetatywne (ziemniak, truskawki przez rozlogi)

Reakcja obiektu umieszczonego na pożywce:

- kontynuacja naturalnego wzoru rozwojowego zgodnego z kompetencjami tkanki czy organu rośliny

- zmiana naturalnego wzoru rozwojowego, która może nastąpić w sposób spontaniczny lub po zastosowaniu okresl fitohormonow w roznych kombinacjach i stężeniach

Materil wyjściowy do kultury in vitro wykladany na pożywkę nosi nazwe EKSPLANTATU PIERWOTNEGO

Eksplantatem pierw może być:

-merystem wierzch, mikrospory, pylek, zalazki, zalaznie

- blaszka liciowa

- mer katowe

- frag pedu - musie zawierac ten mer boczny

- korzenie, cebule bulwy rozlogi

Najczęściej stos kult in vitro

- kul kalusa, merystemow, protoplastow, zawiesin komorkowych, pylnikow mikrospor : niezaplodnionych zalaznikow, zarodnikow (dojrzalych i nie)

Czynn od kt zal wynik kul in vitro

1. wewnętrzne (zw bezp z eksplantatem)

-genotyp rośliny i dawcy eksplantatu (rodz, gat, odm)

- radz organu tkanki oraz jego wielkość

- stopien zróżnicowania eksplantatu

- stan fizjologiczny rośliny dawcy eksplantatu

- wiek rośliny dawcy eksplantatu

2. zew :

- światło, spektrum, natężenie, cykl dobowy

- temperatura -stala, roznice 2-3 st

- pozywka

POZYWKA FUNKCE

1. dostarcza skl pok i in. Skl potrzebnych do wzrostu rozwoju rośliny.

2. odbiera metabolity wtrne i subst szkodliwe i je neutralizuje. Pożywkę musimy poasazowac co 4 tyg

3. spelnia role fizycznego utrzymania

Składniki pożywki

1. makroelem- podawane w postaci Roz w wodzie

2. mikroelem- -„-

3. zw org - A)witaminy- kw nikotynowy, pirodyksyna, tiamina, M-inosytol, B) aminokwasy - glicyna C) źródła wegla org - monocukry, dwucukry (cukier decyduje o cisnieniu osmotycznym pożywki

4. inne A)hydroliat kazeiny B)mleko kokosowe C)reg wzrostu

5. subst zestalające - agar, agarowa, perlit

REGULATORY WZROSTU (fitohormony, hor roślinne, endogenne, Re roślinne) - zw. Org, kt w b.malych ilościach pobudzaja lub hamuja , modyfikuja proc fzologiczne roślin. _ zw te SA transportowane w rosl od miejsca gdzie SA wytwarzane do miesca gdzie wywieraja swoje dzialanie.

AUKSYNY - wzrastac - zw or kt charakteryzuje zdolność wywoływania wzrostu elongacyjnego kom lodygi, spo podobny do kwasu indolilo-5-octowego IAA.

Funkcje auksyn - pobudzaja (czasem hamuja) wzrost wydluzeniowy kom

-biora udzial w wygięciach fototropicznych (w kier swiatla)

- udz w wygięciu grawitacyjnym

- w zjaw plagiotropizmu - skośnym do wektora grawitacji, wzroście pedow bocznych, rozłogów

- w ustawianiu się liscia pow wierzchnia ku światłu, poprzecznie do grawitacji

- u wielu gat roślin, ściętych kawalkach pedow auksyny gromadza siew ich podstawowej czesci, sprzyjaja regeneracji korzeni

- powoduja zawiazywanie korzeni bocz i przybyszowych

- zzapobiegaja opadaniu lisci i owocow

- uczestnicza w zjaw dominacji wierzcholkowej

- zapoczątkowują działalność kambium na wiosne, wspolpracowujac z giberelinami i cytokininami

- powoduja powstawanie partenokarpicznych (beznasiennych) owocow

- powoduja podzialy kom ( wspolp z cytokininami)

AUKSYNY STOS W KULT IN VITRO:

-IAA - kw .indolio-3-octowy

-NAA- naftanylo3oct

-24D dichlorofenyloksyoct

-IBA-inoliolido3butylowy

-2,4,5 -trichlorofenylooct

GIBERELINY- duza gr hormonow rosl , kt bud chem. Oparta jest na ditespenowym 4 pierscieniowym związku - giberelinie.

- nazwa tych hormonow pochodzi od nazwy grzyba - giberella fujikuroi, u kt po raz 1 znaleziono gibereliny.

Dzialanie :

1.silnie stymuluja wzrost miedzywiezli i wydłużanie pedow

2. u niekt rosli pobudzaja kwitnienie

3. u niekt mogą zastąpić dzialanie dlugiego dnia lub chlodu

4. w kwiatach rozdzielnoplc stymuluja rozwoj kwiatow meskich

5. pobudzaja rozwoj owocni

6 graja wazna role w przerywaniu stanu gleokiego spoczynku w narzadach przetwarzalnikowych

7 dziala synergicznie z auksynami w pobudzaniu dzialallnosci kambium w drzewach iglastych i jabłoniach

Najczęściej stos SA w kulturach in vitro jest kw giberelinowy GA3.

CYTOKININY - zw org kt przyspieszaja podzialy kom. Naturalne cytokininy stanowia jednorodna gr zw - pochodne adeniny.

Dzialanie :

1. SA niebednym czynnikiem podziałów kom

2. pobudzaja roznicowanie się chloroplastow

3 indukuja Roz pedow i rozgałęzianie się

4 opozniaja proc starzenia się narządów (zwłaszcza lisci)

5 mogą wpływać na proces translacji poprzez wbudowanie w cząsteczki tNRNA rRNA

6. mogą występować w polaczeniu z bialkami - po, to może odgrywc role w intensyfikacji procesu fosforylacji

7 bialka łączące się cytokininami mog spelniac role receptora- powst wtedy Pol cytokinina- bialko receptorowe

Cytokininy stos w kult in vitro:

-Zeatyna -( kukurydza)

- kinetyka- benzyloadenina BAP lub benzyloasminoadenia BAP

- 2i P - izoentyloadenina

Stymulacja zarodkow somatycznych : 2 i P , kinetyka

BRASINOSTEROIDY- zw biol czynne , wywodzące się z triterpenow, hydroksysteroidy. Wykazuja duze podobbienstwo do zwierzęcych hormonow sterydowych

Dzialanie:

1. stymuluje wzrost koleoptyli, pedow, SA najaktywniejsze ze wszystkich regulatorow w stymulacji wydłużania się lodyg

2. uruchamiaja roznicowanie się izolowanych kom mezofilu w Derendy ksylemu

3 ich podanie na narzad - biorac pobudza transport zw pok ku temu narzadowi

INIBITORY WZROSTU- zw org kt w stężeniach fizjologicznych hamuja takie procesy jak wydłużanie lodyg i jej wycinkow wrost korzeni kielk nasion otwieranie pakow, kwitnienie

-hamowanie tych procesow ma charakter odwracalny a wiec obniżenie poziomu inhibitora wzrostu w roślinie wzrasta zahamowany poprzedni proces

Inhibitory wzrostu:

_ABA- kw absycynowy

-jasmonidy -kw jasmonowy

-etylen

KW ABSCYSYNOWY:

1.hamuje wzrost pedow , kielk nasion, bulw…

2. przyspiesza kwitnienie, starzenie się org roślinnych

3 .indukuje zrzucanie lisci kwiatow owocow

4 indukuje stan spoczynku zimowego pakow wielu drzew oraz stan nasion

5 stymuluje zamykanie ap szparkowych

6 hamuje fotosynteze i synteze chlorofilu

7 w warunkach stersowych nasila ekspresje genow dla bialek

8 wzrost stez ABA towarzyszy niekorzystnym dla roślin zmianom w środowisku , co wpływa na zwiekszenie odporności roślin na stresy

ETYLEN

1.hamuje dzialanie i wzrost wydłużeniowy kom

2. przyspiesza proc dojrzewania i starzenie się tkanek

3. wydzielenie etylenu często towarzyszy reakcji roślin na stres

EMBRIOGENEZA SOMATYCZNA

Szybki i wydajny sposób wegetatywnego rozmnazania ros polegajacy na indukcji rozwoju zarodkow somatycznych (embrioidow) z tk somatycznej w war in vitro

- pozwala na uniezależnienie produkcji cnnego materialu siewnego od warunkow klimatycznych

-umozliwia przyspieszenie tworzenia nasion u roślin charakteryzujących się dlugim cyklem ich produkcji

- somatyczne zrodki mogą być bezpośrednio lub po wysyszeniu wykorzystywane jako tzw nasiona sztuczne

Embriogeneza somatyczna i zygotyczna podobieństwa i roznice:

***Podobieństwa

1. w proc somatycznej embriogenezy roślin 2 lisciennych występują podobne stadia rozwojowe takie jak wczesnosrodkowa, poznoglobularne, wczesno i poznolancetowate torpedy i liścieniowe.

***Roznice

ZYGOTYCZNA

1.zarodki in vitro rozwijaja się w woreczku zalazkowym w wyniku fuzji gamet

2. zarodki podczas rozwoju w stadium wczesnoglobularnym rozwija się suspensor, kt zanika w stadium torpody lub pozostaje w stadium szczatkowym

3 globularne stadia zarodk SA mniejsze niż somatycznych

4 mer wierzcholkowy zarodk lest lepiej rozwiniety

5. zarodki wytwzarzaja 1 liscien lub 2

6 rozwojowi zarodka towarzyszy rozwoj bielma

7 zarodki zyg otoczone SA zawsze okrywa nasienna

8rozwoj zarodka konczy się owolnym odwodnieniem , kt powoduja stopniowa redukcje metabolizmu , zatem wraz z utrat wody z tk nasienia zarodek przechodzi w stan spoczynku

SOMATYCZNA

1.zarodki rozw się w warunkach in vitro bezp lub pośrednio z kom eksplantantu pierwotnego

2.maja suspensoria

3 globularne stadia SA wieksze niż zygotycznych

4 mer wierzcholkowy jest slabiej rozw

5 wytwarzaja 2 wiecej liścieni i często SA one drobne

6 w rozwoju zarodkow somatycznych nie ma procesu tworzenia się bielma

7 zarodki nie SA okryte okrywa nasienna stad nie ma stadium liścieniowego w postaci „laski”

8 zarodki naturalnie nie przechodza proc uspienia , kiełkują przedwczesnie

9 zarodki produkuja takie same materialy zapasowe jak zygotyczne ale w innym czasie i w innych ilościach

Geneza zarodkow powstających w wyniku embriogenezy som:

1 poj Komorka->zarodek

-wiekszosc zarodkow som wywodzi się bezpośrednio z poj Komorek

- jest to możliwe gdy eksplantatami SA zarodki zygotyczne komorki osrodka , synergidy lub epiderma lisci

2 poj Komorka ->PEM ->zarodek

-poj Komorka dzielac się doprowadza do wytworzenia niewielkiej grupy zwanej proembriogeniczna masa Komorek - PEM

-cecha chartka Komorek tworzących PEM jest także nie rozlaczajaca się po podziałach i wszystkie komorki wchodząc w sklad pojedynczego PEM-u uczestnicza w formowaniu jednego lub kilku zarodk somatycznych

- jest to możliwe w przypadku zawiesin komorkowych , kultur kalusa lub protoplastow

PEM - priembriogeniczna masa komorkowa

Bezposrenia embriogeneza somatyczna

-zarodki som formuja się bezpośrednio tylko z tych Komorek roślinnych , kt SA kompetentne już w momencie izolowania z rośliny macierzystej czyli z proembriooenicznie zdeterminowanych Komorek PEDCs -Komorek predysponowanych do roznicowania zarodka

-PEDCs charakteryzuja się malymi rozmiarami stosukowo gesta cytoplazma, malymi wakuolami, dazym jadrem z wyraźnymi jaderkami oraz plastydem z ziarnami skrobi. Cechuja się duza aktywnością podzialowa i metaboliczna

-po przeniesieniu na pożywkę Pedes nastepuje wyzwolenie naturalnych zdolności embriogennych Komorek i rozpoczynaja się intensywne podzialy komorkowe

-bodzcem wyzwalającym proces embriogenezy bezpośrednie jest glownie egzogenna auksyna

Posrednia embriogeneza somatyczna

1 zar som formuja się z kom kalusa , kt powstaje na eksplantatach roślinnych

2 zywe kom eksplantatu pod wpływem czynnikow kultury ulegaja odróżnicowaniu do stanu merystematy , nastepnie w wyniku podzialu wytwarzaja kalus embriogenny

3 w obrebie kalusa powstaja indukowane embriogeniczne zdeterminowane komorki - IEDCs

4 IEDCs - komorki male o stosunkowo gestej cytoplazmie , duze jadro z Wyżnymi jaderkami i plastycydy zawierające ziarna skrobi

5 kom te po kolejnych podziałach nie rozłączają się i w efekcie doprowadzaja do powstawania PEM-u a z niej do formowania 1 lub kilku zarodkow

Czynnikiem indukującym proes embrion somat jest auksyna zawarta w pożywce

Prawidłowy przebieg emb som w warunkach in vitro zal od 2 warunkow:

1 do zapoczątkowania procesu niezbedna jest w pożywce obecność auksyny lub subst auksynopochodnej . Auksyna stymuluje podzialy komorkowe, wzrost Komorek oraz powoduje rozdzielenie się Komorek potomnych po podziale

- wieksza się zageszczenie Komorek

- docodzi do powstanie IEDCs , a nast. PEM-u

2 z chwila rozpoczęcia embriogenezy konieczne jest obniżenie stężenia lub całkowite usuniecie auksyn z pożywki gdyz hamuje ono rozwoj zarodkow . DLACZEGO???

->z chwila powstawania PEM-u nastepuje zmiana relacji Komorek na uksyne

->auksyna powoduje zwiekszenie kwasowości sciany komorkowej przez co staje się one przez to b. elastyczna i Komorka może rosnac (kwasowa teoria wzrostu)

->auksyna hamuje wnikanie jonow wapnia do Komor PEM-u co ogranicza proaidlowa ekspresje genow i tworzenie kultur biegunowych

Bariery postzygotyczne- ujawniają się po zapłodnieniu, nieprawidłowość zarodka i rozwoju rośliny

* brak rozwoju zarodka

* nietypowy rozwój zarodka wskutek pojedynczego zapłodnienia

- obumieranie zarodka we wczesnej fazie rozwoju

-powstawanie nietypowych nasion

* sterylność roślin mieszańcowych

Kultura in vitro izolowanych niedojrzałych zarodków

Hybrydyzacjia somatyczna

Mieszańce płciowe: podczas fuzje protoplastów z dwóch różnych gatunków protoplasty pobieramy z tk. Liścia i umieszczamy w jednym pomieszczeniu i poddajemy oddziaływaniu czynników- trawienie ścian komórkowych - enzymy pektolityczne + substancje stabilizujące

Dwa rodzaje protoplastów układamy na jednej pożywce, cały ukł. Poddaje się czynnikom destabilizującym w wyniku czego występuje wymiana materiału genetycznego. Czynnikiem destabilizującym jest prąd podawany w postaci impulsów. Kanały otwierają się i następuje wymiana genetyczna protoplastów. Są dipolami - i gdy podłączamy prąd + się przyciągają i łączą protoplasty odpowiednimi biegunami.

Glikol polietylenowy ma dużą masę cząsteczkową i umożliwia on, ze DNA może przenikać z jednego protoplastu do drugiego bo mają podobna masę.

Hybrydy somatyczne- tylko mamy fragment jednego jądra, pół na pół.

INDUKCJA HAPLOIDÓW

Haploidy- rośliny o gametycznej liczbie chromosomów w komórkach somatycznych ( saproficie )

Haploidy dzielimy na :

Euhaploidy ( monoploidy i poliploidy kt. Dzielimy na allopolihaploidy i autopolihaploidy)

Aneuhaploidy ( disomiczne, nullisomiczne, addycyjne, substytucyjne, nieregularne)

Disomiczne- maja dodatkowy chromosom tego samego gatunku

Nullisomiczne- mają o jeden mniej

Addycyjne- mają dodatkowy chromosom innego gatunku

Substytucyjne- chromosom jednego gatunku jest zamieniony na innego gatunku

Euhaploidy - organizmy kt. Mają polowę liczby chromosomów z organizmu wyjściowego

Monohaploidy - haploidy powstałe z org. Diploidalnego, mają pojedynczy zestaw chromosomów w swoich kom.somatycznych. Tylko jeden allel dla jedej cechy. Zawsze sa sterylne.

Polihaploidy - organizm Haploidalny Powstający z organizmu poliploidalnego. Polihaploidy są sterylne lub nie. Jeżeli był tzw.heksaploid( nieparzysty) to będzie on sterylny

Allopolihaploidy - organizmy o wielokrotnej liczbie chromosomów. Poliploid kt. ma co najmniej wiecej niż chromosomy z dwóch organizmów.

Podwójny haploid- to jest haploid kt. po haploidyzacji ma podwojoną liczbę chromosomów

Dihaploid- haploid powstały z tetraploidów

Trihaploid- powstały z heksaploidów

PROCESY WYKORZYSTYWANE DO INDUKCJI HAPLOIDÓW

- woreczek zalążkowy ośmiokomorowy, santypoidy, syneroidy, wtórne jądro woreczka zaląż.- woreczek zalążkowy- gamet.żeński

- budowa ziarna pyłku po mejozie- ziarno pyłku - gametofit męski

Haploidyzacjia ( spontaniczna i indukowana)

Indukowana ( apomiksjia, eliminacja chromosomów, androgeneza in vitro)

Patogeneza haploidalna - rozwój zarodka haploid. Z niezapłodnionej komórki jajowej. Kom. jajowa Musi być zaindukowana.

a)chemiczna, fizyczna - krzyżowanie oddalone dotyczy to pyłku, traktujemy pyłek czynnikiem chemicznym błekin toladeiny, promieniowaniem γ. W krzyżowaniu oddalonym w sposób naturalny pylek jest pozbawiony wnikania.

Apogamia-powstawanie zarod. Haploid. Z innej komórki woreczka zalążkowego niż Komorka jajowa( synergia lub antypoda)

Semigamia- rozwój zarodka haploidalnego posiadającego kom. haploidalne męskie i żeńskie tzw. Zarodek mozaikowaty

Androgeneza apomiktyczna- jest wtedy gdy zarodek powstaje z dzielącego się jądra komórkowego w cytoplazmie komórki jajowej

Poliembromia rzekoma- rozwój zarod. Z niezapłod. Kom.jajowej lub innej kom. woreczka zalążkowego w dodatkowym woreczku zaląż.

Eliminacja chromosomów

Metoda bulbosowa- uzyskuje się w sposób masowy zarodki jęczmienia. Po zapyleniu pyłku hordeum bulbosum po 6-7 tyg. Eliminuja chromosomy i powstają chromosomy hordeum vulgare

Chemiczna- jest b. kłopotliwa , nie stosowana raczej, związki PVP , CIPC to zw. Które eliminuja chromosomy losowo, ale nie koniecznie w takiej ilości jak my chcemy. Powstają aneutraploidy ( nie maja praktycznego zastosowania)

Androgeneza in vitro - jest to rozwój zarod. Haploid. Z męskich kom. generatywnych w warunkach in vitro. Ma zastosowanie do wsyztskich gatunków . Męskimi kom. są mikrospory, one sa źródłem zarodkow. Mikrospory sa to kom. postmejotyczne . Na pożywki możemy wykładać te części które maja mikrospory czyli pylniki. Niektóre mikrospory nie rozwijaja się i dlatego potrzebna jest tk. Tapetum ( dzieki niej się rozwijaja) i musza mieć one te tkanki przez pewnien okres i jest to nazywane prakulturom w pylniku

Ginogeneza in vitro( zaląznie zalążki)- rozwój zarodników haploid. Żeńskich kom. rozrodczych, kom. wor. Zalążkowego i niezaplodniona kom jajowa , synergidy, rzadko antypody. Nie możliwa jest izolacja zalążków ze wzgl. Na ich rozmiary wiec korzysta się z możliwości wykładania całych zalążni.

Czynniki kt. decydują o skuteczności androgenezy lub ginogenezy in vitro

- rośliny dawcy eksplantatow

*gatunek poloidalnosci i genotyp

* warunki wzrostu, stan fizjologiczny\

- działania róznymi czynnikami na roślinę dawce lub na eksplantaty

* czynniki chemiczne

* czynniki fizyczne np. szok termiczny

- sposób przeprowadzania kultur

* całe pylniki, zaląznie

* uwolnione mikrospory, pojedyncze zalążki

* metody łączone

- warunków kultur

* pożywka- skład , konsystencja, wartość osmotyczna

* temperatura

* światło

Depresja wsobna- z każdym pokoleniem spada plon, rośliny potomne są słabsze, ich vigor jest słabszy. Rozwiązaniem na to są podwojone haploidy

Haploidyzacja melonu - przez 36 tyg = 9 mcy otrzymujemy podwojne haploidy

Podstawowymi korzyściami wynikającymi z wprowadzenia systemu haploidalnego do hodowli są:

- skrócenie czasu produkcji linii homozygotycznych

- zwiekszenie efektywności selekcji pożadanych rekombinantów

-urwalanie addywnej zmienności w czystych liniach (zmienność addywna okresla cechy mierzalne. Wartość danej cechy ilościowej)

MODYFIKACJA GENETYCZNA ( Inzynieria genetyczna)

Inzynieria genetyczna- to zespól technik umożliwiających swobodne przenoszenie genów z dowolnego organizmu do każdego innego

Czyli określony organ może wytwarzać polipeptyd, kt. jest w naturze produkowany przez inny organizm

Gatunek- zbiór osobników mający wpółna pulę genowa, mogą się rozmnażać i wydawać płodne potomstwo

GMO- organizm modyfikowany genetycznie, organizm inny niż organ człowieka w kt. materiał genetyczny został zamieniony w sposób niezachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżownia lub naturalnej rekombinacji

Schemat postępowania:

- identyfikacjia genu kodującego interesujący nas polipeptyd

- przeniesienie zidentyfikowanego genu z organizmu, w kt. wystepuje naturalnie

Identyfikacja genu kodującego określony polipeptyd

1.polipeptyd-ustalenie składu aminokwasowego

2.mRNa

3.c DNA

4. znakowanie( radioaktywne za pomocą izotopów)

5.hybrydyzacja z genomowym DNA i i autoradiografia

6. zlokalizowany i zidentyfikowany gen

METODY WPROWADZANIA OBCEGO DNA DO ROSLIN

1. Transformacja bezposrednia( bezwektorowa)

- Transformacja protoplastów- stosujemy mikrowstzreliwanie, mikroinjekcja, metoda węglikowa

2. Transformacja pośrednia ( wektorowa)

Transformacja protoplastów polega na tym, że wprowadza się obcy DNA do protoplastów do jakiejś tkanki. Może to być dwiema metodami:

-elektoporowa- polega na tym ze w tym ukł. Umieszcza się protoplasty i wyizolowane DNA w zbuforowanej pożywce. Cały ukł. Poddaje się wysokiemu napięciu 10000 V te impulsy powoduja destabilizację błony i na zasadzie dyfuzji i przyciąganie DNA wnika do wnętrza DNA. DNA może ulec integracji DNA protoplastu.Protopl. te wyklada się na pożywki i regeneruje rośliny. Protopl. W kt. nie ma DNA usuwamy, robimy selekcje. Przy DNA mamy kais gen markerowy lub antybiotyki

-PEG- ma masę cząstęczkową 20…. Która działa na zasadzie jak prąd

MIKROWSTRZELIWANIE- to metoda polegająca na wprowadzaniu obcego DNA naniesionego na mikropociski wstrzeliwane bezpośrednio do tk.roslinnej za pomocą armatki genowej= działki enetycznej lub aparatem do mikrowstrzeliwania. Metoda biopalicyjna jest tak nazwana. Mikropociskami są mikroskopijne opiłki metali szlachetnych lub półszlachetnych: złoto, platyna, odfram???. Opiłki pokrywa się warstwo DNA nastepnie umieszcza się w zbiorniczku na nabój i pod działaniem DNA wstrzeliwuje się na ślepo. Często dochodzi do mikrouszkodzeń kt. szybko się regenerują.Metoda jest skuteczna. Wprowadza się gen markerowy. Jedyna metoda transformowania roślin jednoliściennych : ryż. Pszenica, kukurydza

MIKROINIEKCJA- mikrowstrzyki

Polega na wstrzykiwaniu bezpośrednio do jądra DNA- to jest na cienkiej kapilarze. Metoda bezprecyzyjna jeśli chodzi o precyzje. Jest możliwa wyłącznie w przypadku dużych jąder komórkowych porównywalne z kom. jajowych ssaków, coś takiego ma kukurydza. Metoda stosowana w przypadku zwierząt.

METODA WEGLIKOWA- węglik krzemu jest wykorzystywany. Tworzy się zawiesine komórkową, w tej zawiesinie umieszcza się DNA, następnie oddaje się kryształki weglika krzemu i dalej poddaje się mechanicznemu wytrzasaniu. Kryształki robia mikrouszkodzenia i wnika DNA do układu. Nie stosowana. Wada- nie mamy protoplastów tylko sciany komorkowe( przeszkoda) tworza się agregaty komoorkoweKrysształki weglika krzemu wytwarzaja duże szkody- duże uszkodzenia

TRANSFORMACJA POSREDNIA SKŁ. SIĘ z 3 etapów:

1. Otrzymywanie pozadanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy

2. wprowadzenie obecego DNA do wektora

3. wprowadzenie wektora nioosacego w sobie DNA dawcy do Komorek biorcy w taki sposób by DNA dawcy połączył się trwale z DNA biorcy

WEKTOR TRANSFORMACJI- niewielka czast. DNA mająca zdolnośc przenoszenia obcego DNA oraz zdolność do autonomicznej replikacji. Plazmidy są doskonałymi wektorami transformacji. Maja zdolność do replikacji.

Wektory:

-prokariotyczne

-eukariotyczne

-wahadłowe

Cechy dobrego wektora

1.Dobzre poznany biologicznie i genetycznie

2. zawiera pojedyncze miejsce restrykcyjne rozpoznawane przez przynajmniej jeden enzym restrykcyjny= nozyce genowe

3. posiada geny twz. Markerow selektywnych( odroznia plazmidy gdzie gen wprowadza, a gdzie nie ma)

4 Miejsce restrykcyjne nie może znajdować się w pobliżu genow markerow selektywnych

5. Posiada co najmniej jedna sekwencje startu replikacji

6. nie zawiera genow stanowiących zagrozenie dla czlowieka lub środowiska

Przygotowanie wektora transformacji- rekombinacja in vitro

1trawienie tym samym enzymem restrykcyjnym

2. ligacja

3. namnazanie

Metoda transformacji roślin za pomocą Agrobacterium

Agrobacterium- bakterie glebowe, bakt. Patogeniczne u roślin dwuliściennych wywoluje choroby

Agrobacterium tumefaciens

-plazma

-choroba - guzowatość korzeni

Agrobacterium rhizogenes

- plazmid Ri

- choroba włosowatość korzeni

Naturalny system transformacji roślin

Naturalny system jest oparty na tym ze w plazmidach sa geny kt. koduja subst. Zwane opiny. Opiny to suubst. Niezbędne do zycia bakteri, ale same bakterie produkowac ich nie mogą. Bakterie w okolicach zranień wnikaja w naturalny sposób w plazmidy do tych zranien i wtedy produkowane sa opiny.

Budowa plazmidu Ti

LB I RB , T-DNA, rejon vir, ori, ko , trol

Rejon vir- wirulencjia- rejon odpowiedzialny za infekowanie kom. roślinnych

Ori- miejsce inicjacji replikacji

KO nierozbrojony- katabolizm opin

Tra- tam jest hgen odporności na antybiotyki

T- DNA przenoszony DNA ograniczony sekwencjami ogranicznymi ( krotkie 25 nukleotyd RB I LB

#- nieznane sekwencje

LB I RB + T- DNA - ulega przenoszeniu genu z jednego gatunku do drugiego

ZASTOSOWANIE INZYNIERII GENETYCZNEJ w hodowli roślin uprawowych

2006 - 100mln ha GMO

- wprowadzenie do genomu roślin uprawnych genow zwiększających ich tolerancje na stres i niekorzystne warunki srodowiskanp. Zasolenie, jony metali ciezkich, niskie temp, susza

- zwiekszenie wartości żywieniowych i technologicznych roślin uprawnych( ziemniaki p podwyższonej zawarotosci skrobi)

---