Biologia Komórki - materiały na egzamin

Wykład II: Błona komórkowa: funkcje, budowa i wplatanie białek oraz połączenia między komórkami (poprawiony schemat kotranslacji)

Program wykładów z biologii komórki:

1. Komórkowa budowa organizmów: organelle (przedziały) komórkowe: budowa i funkcja

2. Metody badania komórek

3. Macierz zewnątrzkomórkowa i rola jej składników, błona podstawna

4. Zewnętrzna błona komórkowa - budowa, synteza jej składników oraz funkcje (izolacja od środowiska kontakt ze środowiskiem, kontakty międzykomórkowe i kontakt z błoną podstawną)

5. Transport do komórki: bierny i czynny

6. Transdukcja sygnału przez błonę oraz przekaźniki drugiego rzędu

7. Przedział jądrowy - informacja genetyczna i synteza białek

8. Cykl komórkowy i jego regulacja.Aktywacja mejozy

9. Błony wewnętrzne: transport masowy, endo- i egzocytoza

10. Różnicowanie komórek, onkogeneza i apoptoza

11. Cytoszkielet: cytokineza i ruch

12. Chloroplasty, mitochondria i peroksysomy - system energetyczny komórki

13. Pozajądrowa informacja genetyczna

14. Porównanie Prokariontów i Eukariontów, a także komórki zwierzęcej i roślinnej

Wykład II: Błona komórkowa: funkcje, budowa i wplatanie białek oraz połączenia między komórkami (poprawiony schemat kotranslacji)

Błona komórkowa

Błona komórkowa ma grubość około 5 nm, co odpowiada 50 atomom. Jej najważniejszą funkcją jest ochrona przed rozproszeniem się zawartości komórki lub mieszaniem się jej z otaczającym środowiskiem.

U organizmów eukariotycznych istnieje wiele błon wewnętrznych tworzących przedziały komórkowe o różnej zawartości białek, pH itp.

Hydrofobowe wnętrze dwuwarstwy stanowi barierę dla większości cząstek hydrofilowych:

• małe cząsteczki niepolarne, np. tlen i dwutlenek węgla, dyfundują łatwo

• nie naładowane cząsteczki polarne dyfundują łątwo pod warunkiem, że są małe (woda, etanol), większe, np. glukoza, nie dyfundują prawie wcale

• błona jest wysoce nieprzepuszczalna dla jonów i cząstek naładowanych.

Struktury błonowe w komórce:

• otoczka jądrowa, retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego, endosomy i lizosomy - powstały przez wpuklenie błony komórkowej. Tworzą one system błon wewnętrznych. Wnętrze tych organelli komunikuje się z wnętrzem innych organelli i z otoczeniem komórki przy pomocy pęcherzyków (z wyjątkiem otoczki jądrowej).

• mitochondria i plastydy - powstały z wchłoniętych bakterii

Budowa błony:

Błony dobrze bada się na przykładzie erytrocytów - sa to komórki posiadające w środku w zasadzie tylko hemoglobinę; w hipotonicznym roztworze błona pęka i zawartość wylewa się (wtedy można odwirować samą błonę - "ducha" - która w środowisku wodnym sama zamknie się tworząc pęcherzyk). Błona zamyka się "normalnie", jeśli w środowisku znajdują się jony magnezu. Jeśli ich nie ma, zamyka się "na lewą stronę".

Błona to dwuwarstwa lipidowa, zbudowana z listka zewnętrznego i wewnętrznego.

Jej głównym składnikiem są fosfolipidy - cząsteczki mające hydrofilowe głowy i hydrofobowe ogony, dzięki czemu posiadają właściwości amfipatyczne. Powoduje to, że w wodzie tworzą dwuwarstwy, które eliminują otwarte krawędzie (są to pęcherzyki = liposomy lub płaskie dwuwarstwy rozdzielające przedziały wodne).

Takie pęcherzyki można stworzyć w laboratorium: błona pod wpływem detergentów lub ultradźwięków dezintegruje i tworzy małe pęcherzyki, a następnie rozpada się na fosfolipidy i białka. Po usunięciu białek błona przyjmuje kształt pęcherzyka.

Fosfolipidy:

Fosfolipidy to cząsteczki zbudowane z 2 kwasów tłuszczowych (długie, hydrofobowe łańcuchy, nasycone - proste lub nienasycone - mające sztywne "kolanka"), glicerolu (który wraz z kwasami z resztami kwasów tłuszczowych tworzy fosfatydyl) oraz różnych hydrofilowych cząsteczek. Wyróżniamy:

• fosfatydyloserynę

• fosfatydylocholinę

• fosfatydyloinozytol

• fosfatydyloetanoloaminę

W skład błony wchodzi także np. sfingozyna (z choliną), która łatwo łączy się z węglowodanami tworząc glikolipidy (grupy cukrowe uzyskuje wewnątrz aparatu Golgiego, a więc znajdują się one na powierzchni pozacytozolowej; po przeniesieniu do błony komórkowej trafiają na zewnątrz komórki tworząc glikokaliks, który chroni komórki i bierze udział w ich rozpoznawaniu). Glikolipidy są czynnikiem określającym grupy krwi! A i B różnią się ostatnim cukrowcem, 0 - brak ostatniego cukrowca.

Płynność błony zależy między innymi od stopnia nasycenia jej kwasów tłuszczowych. Im więcej jest nienasyconych, tym jest bardziej płynna, gdyż wiązanie podwójne jest sztywne - łańcuch zagina się i zajmuje więcej miejsca. U zwierząt występuje też cholesterol - krótkie, sztywne cząsteczki, które wypełniają wolne miejsca pomiędzy łańcuchami i usztywniają błony. Błona jest sztywniejsza w niskich temperaturach.

Błona ma strukturę płynnej mozaiki - jej elementy przemieszczają się swobodnie w obrębie jednej warstwy. Np. po fuzji dwóch komórek, których białka zostały wyznakowane znacznikami fluorescencyjnymi, na początku łatwo rozróżnić połówki, ale już p 30 minutach błona stanowi jednorodna mieszaninę.

Błony są asymetryczne - mają listek cytozolowy i pozacytozolowy, które zachowują orientację wobec cytoplazmy. Fosfolipidy bardzo rzadko samoistnie przeskakują z jednego listka na drugi (tzw. ruchy flip-flop). Istnieje jednak enzym flipaza, która "wsysa" fosfolipidy i wypuszcza je po drugiej stronie błony. Pomimo tego skład listków bardzo się różni - w pozacytozolowym przeważa sfingomielina i fosfatydylocholina, w cytozolowym fosfatydyloseryna i fosfatydyloetanoloamina

Synteza fosfolipidów:

W błonie znajdują się kwasy tłuszczowe. Zaktywowany przez koenzym A kw. tłuszczowy (acylo-CoA) może połączyć się z 3-fosfoglicerolem (reakcję tę katalizuje acylotransferaza - CoA odpada, powstaje kwas fosfatydylowy, tkwiący łańcuchem w błonie). Reakcja powtarza się (do tego potrzebna druga cząsteczka zaktywowanego kwasu tłuszczowego).

Powstaje 1,2-diacylo-3-fosfoglicerol, enzym fosfataza odłącza fosforan. 1,2-diacyloglicerol reaguje z CDP-choliną (lub CDP-inozytolem itp.), powstaje fosfatydylocholina, odłącza się CMP.

Białka błonowe:

W błonie komórkowej znajduje się wiele białek o różnych funkcjach. Mogą być one receptorami, enzymami, służyć do transportu substancji przez błony lub wiązać komórkę z innymi komórkami lub macierzą zewnątrzkomórkową (integryny).

Białka mogą przechodzić przez błonę pozostawiając po jednej lub obu jej stronach część cząsteczki (b. transbłonowe), lub być związane z nią poprzez oddziaływania z innymi białkami (np. kinaza białkowa C). Do błony mogą przyczepiać się także fragmentami niebiałkowymi (np. grupą mirystylową (CH₂)₁₂CH3 lub farnezylową - lipid z dużą ilością wiązań nienasyconych). Każde białko błonowe ma określoną orientację!!!

Białka integralne zakotwiczone są w błonie alfa-helisami, na zewnątrz których znajdują się hydrofobowe łańcuchy boczne, lub beta-harmonijkami (struktura przypominająca cylinder, tworzy duże, wypełnione woda pory, np. poryny w zewnętrznych błonach mitochondriów. Mogą przenikać przez błonę raz lub wiele razy.

W części zewnętrznokomórkowej często znajdują się fragmenty połączone z cukrowcami (ułatwiaja przyczepianie się do różnych substancji), część wewnętrzna służy do przekazywania informacji lub wiązania się z czymś. Do b. integralnych na zewnątrz przyczepione są białka okładzinowe.

Synteza białek błonowych:

Białka błonowe syntetyzowane są przez rybosomy przyczepione do szorstkiej siateczki endoplazmatycznej. Translacja rozpoczyna się, gdy połączą się obie podjednostki rybosomu oraz mRNA. Zwykle pierwsza powstaje sekwencja sygnałowa o długości 21 aminokwasów. Do niej dołącza się peptyd sygnałowy SRP (cząsteczka rozpoznająca sekwencję; po przyłączeniu hamuje translację). Potrzebne jest też 7s RNA.

W błonie znajduje się receptor SRP, który wiąże SRP i rybosom (wtedy otwiera się w nim kanał translokacyjny). Sekwencja sygnałowa dostaje się do kanału translokacyjnego, wznowienie translacji, SRP wraca do cytoplazmy.

Syntetyzowany polipeptyd dostaje się do środka tworząc pętlę (bo sekwencja sygnałowa pozostaje w kanale). W pewnym momencie peptydaza sygnałowa (ze światła ER) odcina sekwencję sygnałową (wypada ona wtedy do cytoplazmy i ulega degradacji). Białko zostaje w ten sposób w świetle ER.

Białko może być przeplecione przez błonę raz lub kilka razy: wtedy w pewnym momencie pojawia się sekwencja stop-transfer. Zostaje ona uwolniona z kanału poprzez jego boczne otwarcie i zakotwiczona w błonie (równocześnie odcinana jest sekwencja sygnałowa). Translokacja zostaje rozpoczęta ponownie przez sekwencję start-transfer itp. Po odcięciu peptydu sygnałowego białko pozostaje w błonie.

Gotowe białko chronione jest przez chaperony, które fałdują je i modyfikują (np. bip, który przyłącza do białka cukrowce); mogą też być chronione przez polisacharydy (glikozylacja prowadzona jest przez lipid dolichol - łączy się on z wielocukrami i przenosi je na asparaginę).

Transport białek błonowych:

Białka (i lipidy) transportowane są do innych organelli błonowych z ER przy pomocy pęcherzyków. Wędrują one do aparatu Golgiego ("wchodzą" po stronie cis, "wychodzą" po stronie trans), a stamtąd do błony komórkowej lub poprzez endosomy do lizosomów.

Zachowana przy tym zostaje orientacja błony wobec cytoplazmy (wnętrz siateczki staje się np. warstwą zewnętrzną błony komórkowej).

Środowisko komórek:

• Jednokomórkowce kontaktują się bezpośrednio ze środowiskiem zewnętrznym. Np. bakterie dzięki swojej ścianie komórkowej są bardzo odporne na zmienne czynniki środowiska, mogą nawet żyć w powietrzu, choć komórka wymaga w zasadzie środowiska wodnego.

• Dla komórki roślinnej substancja zewnątrzkomórkową jest ściana komórkowa. Powstaje ona początkowo jako przegroda pierwotna, później odkładane są kolejne warstwy - może być także wzmacniana takimi substancjami jak lignina czy suberyna.

Kontakt z innymi komórkami zachodzi przez plazmodesmy - połączenia cytoplazmy komórek wysłane błoną. Może przez nie także przechodzić ER.

Ściana zbudowana jest z fibryli celulozowych (polimer glukozy) - cienkie mikrofibryle układają się w makrofibryle ułożone względem siebie w sposób uporządkowany. Na nich znajduje się hemiceluloza (glukoza, ksyloza, fukoza, galaktoza), która łączy się z falistymi cząsteczkami pektyn (kwas będący pochodna celulozy i ramnoza powodująca "falowanie" cząsteczki).

Monomery cukrowców transportowane są po mikrotubulach do kompleksów enzymatycznych, i przez nie transportowane na zewnątrz, a następnie wbudowywane do pęczka łańcuchów tworzących mikrofibrylę. Powstająca fibryla "wysuwa się" z kanalika, w którym odbywa się łączenie. Na początku układają się chaotycznie, kolejne tworzą pęczki (spowodowane jest to prawdopodobnie przesuwaniem się enzymów wzdłuż mikrotubul...)

• W organizmach zwierzęcych komórki otoczone są substancja (matriks) zewnątrzkomórkową i znajdują się na błonie podstawnej (we wszystkich tkankach, ale najbardziej widoczna w tkance nabłonkowej).

Skład substancji zewnątrzkomórkowej:

• glikozaminoglikany (GAG) - duże polimery dwucukrów. Dołączają się do rdzeni białkowych tworząc "szczoteczki". Są silnie hydrofilowe, tworzą żele, przestrzenie między komórkami. Proteoglikany! (kwaśne mukoplisacharydy?). Do nich przyczepione np. siarczan keratanu i siarczan chondroidyny. mają powinowactwo np. do czynników wzrostu.

• fibronektyny (glikoproteiny) - łączą kolagen lub proteoglikany z integrynami

• laminina (glikoproteina) - integryny + kolagen, entaktyny, proteoglikany

• entaktyna - mała cząsteczka, też łączy ze sobą inne

• perlakan - glikoproteina

• kolagen - tworzy długie, sztywne włókna. Syntetyzowany w formie łańcuchów, do których dołączane są grupy cukrowe. 3 takie łańcuchy owijają się wokół siebie tworząc prokolagen (z telopeptydami na końcu). W takiej formie transportowany na zewnątrz komórki, tam odcinane telopeptydy. "Gotowy" kolagen (tropokolagen) agreguje się we włókienka. Włókienka te ułożone są regularne - ich budowa (główka + ogon) sprawia, że widoczne jest to jako prążki.

• na powierzchni komórek np. jelita znajduje się glikokaliks - płaszcz cukrowcowy.

Istnieje około 20 typów kolagenu. Najważniejsze to:

• I - w skórze, kościach, ścięgnach, dentynie zębów

• II - chrząstka, tętnice, ciałko szkliste oka

• III - skóra, macica, naczynia krwionośne

• IV - w błonie podstawnej nabłonka

• V - błona podstawna mięśni i innych komórek mezenchymy

Białka transbłonowe biorące udział w łączeniu komórek z macierzą zewnątrzkomórkową i innymi komórkami:

• selektyny - wiążą glikoproteiny i mucyny błonowe; tworzą przejściowe połączenia

• integryny - zbudowane z 2 podjednostek - alfa i beta. tworzą trwałe połączenia z macierzą lub błoną podstawną. Łączą się z kolagenem, lamininą, fibronektyną lub IgCAM, a po stronie cytoplazmatycznej z winkuliną, która ma powinowactwo do aktyny.

• 
  kadheryny - tworzy homofilowe połączenia między komórkami (tzn. kadheryny jednej komórki łączą się z takimi samymi kadherynami innej komórki). Ich domeny cytoplazmatyczne łączą się z kateninami, a one z cytoszkieletem.

• immunoglobuliny IgCAM - tworzą połączenia homofilowe lub z integrynami.

integryna

Białka wewnątrzkomórkowe wchodzące w skład połączeń:

• z kadherynami łączą się: kateniny mające powinowactwo do filamentów aktynowych, mogą współpracować z kinazami tyrozynowymi i receptorem dla EGF (naskórkowego czynnika wzrostu); oraz plaktoglobina, desmoplakiny i plektyna łączące się z filamentami pośrednimi

• Z integrynami łączą się: winkulina, talina, tensyna, paksylina, dystrofina (w mięśniach), alfa-aktynina, FAK (kinaza płytek przylegania, bierze udział w przekazie informacji).

Połączenia komórek z macierzą zewnątrzkomórkową:

• hemidesmosomy - w błonie znajdują się integryny. Po zewnętrznej stronie komórki łączą się z lamininą, po wewnętrznej z dystroglikanami (w mięśniach), a dalej z filamentami pośrednimi.

• przyczep ogniskowy - integryny po zewnętrznej stronie łączą się z fibronektyną, po wewnętrznej z taliną, winkuliną, paksyliną, alfa-aktyniną i filamentami aktynowymi.

Połączenia między komórkami:

Umożliwiają istnienie tkanek, zwłaszcza nabłonkowej, w której komórki muszą być ściśle ze sobą połączone.

Wiele komórek, np. nabłonek jelita, jest spolaryzowana, mają część apikalną kontaktującą się ze środowiskiem i część bazalną (styka się z błona podstawną, stabilizuje komórkę.

• ścisłe (barierowe, styk zwarty) - w błonie znajdują się białka integralne przechodzące z jednej komórki do drugiej (okludyna i klaudyna). Jest to połączenie mechaniczne, stanowi barierę dla przemieszczania się np. białek błonowych i "mieszania się" środowisk znajdujących się po 2 stronach komórki.

• desmosomy - po zewnętrznej stronie błony znajdują się białka (kadheryny), z którymi łączą się odpowiednie białka (plektyna, plaktoglobina) mające powinowactwo do filamentów pośrednich

• komunikatywne - 6 białek (koneksonów) tworzy w błonie kanał, w komórce obok taki sam kanał kontaktuje się z nim (połączenie między cytoplazmą komórek!)

• adhezja komórkowa (połączenia czasowe)

• z kadheryny (w obecności jonów wapnia) - obwódki zwierające - kadheryny + filamenty aktynowe
  

• przez białka adhezji komórkowej IgCAM

• przez integryny (integryna - integryna)

• przez selektyny połączone z kadheryną lub CAM

Kora komórki w erytrocytach:

W błonie znajdują się białka 3 i 4 linii, łączą się z ankiryną, która ma powinowactwo do spektryn tworzących sieć. Do spektryn dołączone są filamenty aktynowe.

Kora komórki w mięśniach:

W błonie znajdują sie dystroglikany i stabilizujące je sarkoglikany. Zewnętrzna domena dystroglikanu ma powinowactwo do lamininy, a integralna - do dystrofiny. Dystrofiny łączą się z filamentami aktynowymi.(czy w błonie nie ma przypadkiem integryn?!)

Dystrofie - choroby polegające na stopniowym zaniku dystrofiny (od 4-5 roku życia), powoduja zanik mięśni.

Wykład III: Transport przez błony

Hydrofobowe wnętrze błony komórkowej stanowi barierę dla większości cząstek hydrofilowych:

• małe cząsteczki niepolarne, np. tlen, azot i dwutlenek węgla, dyfundują łatwo

• nie naładowane cząsteczki polarne dyfundują łątwo pod warunkiem, że są małe (etanol, mocznik, woda - ale dla niej istnieja specjalne kanały), większe, np. glukoza, nie dyfundują prawie wcale

• błona jest wysoce nieprzepuszczalna dla jonów i cząstek naładowanych.

Żeby odbył sie transport, w zasadzie powinna istnieć różnica stężeń danej substancji pomiędzy przedziałami oddzielanymi błoną. Istnieją jednak specjalne "urządzenia" mogące transportować przez błonę wbrew gradientowi stężeń (i radzące sobie z cząsteczkami, które normalnie przez błonę przenikać nie mogą).

Wyróżniamy 3 podstawowe typy przenośników:

• pompy jonowe - zależne od ATP(wymagają nakładów energii
  

• kanały jonowe - "otwory" w błonie otoczone białkami, mogą być bramkowane (tzn. otwierane / zamykane) przez cząsteczkę (ligand) lub różnicę potencjaów.

• transportery - nie potrzebują energii ATP, zmieniaja konformację dzięki dołączeniu jakiegoś jonu i wtedy "odkręcają się" na drugą stronę przenosząc czasteczkę z jednej strony błony na drugą.

Przenośniki można podzielić też na:

• uniportery - przenoszone 1 typ cząsteczek w 1 stronę

• symportery - przenoszące w tę samą stronę 2 różne jony (jeden zgodnie z gradientem stężeń, drugi wbrew temu gradientowi, korzystając z energii transportu pierwszego jonu

• antyportery - przenoszące 1 cząsteczke w 1 stronę, a drugą (inną) w druga stronę.

Pompy możemy podzielić w zależności od ich budowy na:

• klasy P - proste pompy z podjednostek alfa i beta. Przenoszą H, Na, Ca, K.

• klasy F - zbudowane z minimum 8 podjednostek, przenoszą H zgodnie z gradientem stężeń, jednocześnie syntetyzując ATP (w mitochondrium)

• klasy V - minimum 7 podjednostek; przenoszą H hydrolizując ATP (w błonie wakuoli)

Wewnętrzny skład jonowy komórki bardzo różni się od środowiska zewnętrznego. Na zewnątrz znacznie więcej jest jonów Na, Ca, Cl, H, w komórce dużo jonów potasu i ujemnie naładowanych cząsteczek organicznych.

Dzięki różnicy stężeń kationów Na wytwarza się różnica potencjałów, niezbędna dla np. przekaźnictwa nerwowego. Pompa sodowo-potasowa zbudowana jest z 2 podjednostek (alfa i beta). Ma ona wysokie powinowactwo do Na w 3 miejscach i 2 o niskim powinowactwie do potasu. Na bardzo chętnie łączy się z podjednostką alfa, wtedy następuje hydroliza ATP do ADP i jony Na wyrzucane są po drugiej stronie (na zewnątrz komórki), gdyż miejsca wiązania tracą do nich powinowactwo. Równocześnie miejsca wiązania K uzyskują wysokie powinowactwo do tych jonów, łączą się z K, pompa zmienia swoją konformację i obraca się przy jednoczesnej defosforylacji.

Pompa wapniowa - wypompowuje wapń z cytozolu (do niego dostaje się on przez kanały wapniowe) - 2 kationy dołączają się do pompy dzięki fosforylacji, przenoszone są na zewnątrz komórki lub do wnętrza ER, pompa po defosforylacji wraca do poprzedniego położenia. Do aktywacji pompy potrzebny jest magnez.

Błona wakuoli roślinnej:

W wakuoli środowisko kwaśne (niewielka różnica potencjałów, ale za to duża pH. W błonie znajdują się:

• pompa wodorowa (utrzymuje kwaśne pH, H do środka, hydroliza ATP)

• pompy protonowe (Ppi -> 2Pi)

• kanały transportujące do środka aniony (Cl, NO3...)

• antyporty (dzięki transportowi protonów zgodnie z gradientem stężeń, a więc na zewnątrz wakuoli, do środka dostają się jony Na, Ca i sacharoza).

Transport glukozy:

Przenośnik ma 2 możliwe konformacje, pomiędzy którymi przypadkowo oscyluje. Przepływ zgodny z gradientem stężeń - łączy się z cząsteczką, tworzy się kanał, glukoza przenoszona na drugą stronę.

Transport w komórkach nabłonka jelita:

Glukoza przenoszona jest ze światła jelita wraz z dwoma kationami Na (ich gradient zapewnia odpowiedni kierunek transportu). Symportery znajdują się tylko na błonie kontaktującej się ze światłem jelita dzieli połączeniom barierowym uniemożliwiającym swobodne przemieszczanie się białek. Glukoza przenika do naczyń krwionośnych dzięki uniporterom (zgodnie z gradientem stężeń), a Na wypompowywany jest do krwi przez pompę sodowo-potasową.

Transport tlenu i dwutlenku węgla:

W płucach tlen dostaje się do erytrocytów zgodnie z gradientem stężeń (duże ciśnienie tlenu, małe - dwutlenku węgla). Wiąże się tam z hemoglobiną. Jony HCO3 (które dostają się do komórki przez antyport przenoszący też anion Cl) zostają przez anhydrazę węglanową (?) rozłożone na wodę i dwutlenek węgla, który zgodnie z gradientem "ucieka" na zewnątrz.

Odwrotny proces zachodzi w kapilarach: w środowisku znajduje się dużo dwutlenku węgla, a mało tlenu. Dwutlenek węgla dostaje się do erytrocytu i zostaje zamieniony na jony węglanowe przez anhydrazę węglanową (?), a następnie wydostaje się z komórki przez symport (białko 3 linii).Tlen natomiast odłącza się od hemoglobiny i dyfunduje na zewnątrz.

Utrzymywanie odpowiedniego ciśnienia osmotycznego w komórce zwierzęcej: (czy ktoś się przypadkiem nie orientuje, czy to jest pęcherzyk płucny, czy cos innego???)

Woda rozszczepiana jest na H+ i OH-. Jony OH łączą się z dwutlenkiem węgla tworząc HCO3 i usuwane są z komórki jako jony węglanowe antyportem przenoszącym je wraz z jonami Cl (których jest dużo w środowisku). Aniony te są z komórki usuwane przez kanał. Protony wydalane są z komórki dzięki antyportowi H+/K+ ATPazie (wyrzuca protony, a do środka wpuszcza potas, który może zostać usunięty przez kanał.

Odzyskiwanie turgoru przez komórkę roślinną:

W środowisku izotonicznym (ok. 0,15 M NaCl) komórka nie traci wody. W środowisku hipertonicznym (np. 0,25 M NaCl) woda dąży do wyrównania stężeń i "ucieka" z komórki.

Turgor komórka odzyskuje przez intensywne wypompowywanie protonów przez antyport (Na dostaje się wtedy do komórki). Aniony Cl wpompowywane są przez antyporty, które usuwają z wody Hco3. Dzięki temu w komórce znajduje się więcej NaCl i woda wyrównuje różnicę stężeń wpływając do komórki.

Wykład IV: Hormony - transdukcja sygnału i jego losy w komórce.

Sygnalizacja w organizmie:

• endokrynowa (hormonalna)- hormony wydzielane sa do krwiobiegu i rozprowadzane po całym ciele.

• parakrynowa - mediatory lokalne wydzialane są do środowiska zewnątrzkomórkowego, działają miejscowo.

• autokrynowa - komórka wydziela cząsteczki sygnalizacyjne i ma dla nich receptory

• nerwowa

• przez bezpośredni kontakt komórek - cząsteczki sygnałowe zawarte są w błonach komórkowych, a receptory na błonach innych komórek (ważne np. podczas determinowania losów komórek w rozwoju zarodkowym)

Małe hydrofobowe cząsteczki sygnałowe (np. hormony sterydowe i hormony tarczycy) przechodza przez błone komórki docelowej i wiążą się z receptorami w cytozolu lub jądrze. Receptory te są zwykle regulatorowymi białkami genów - po zaktywowaniu łączą się z sekwencjami regulatorowymi DNA, które inicjuja lub hamują transkrypcję danego zestawu genów. Zdarza się też, że receptorem jest enzym (w ten sposób działa np. NO powodujacy rozszerzanie sie naczyń krwionośnych).

Większość cząsteczek sygnalizacyjnych to hydrofilowe białka, które musza połączyć się z receptorami znajdującymi się na błonie komórkowej komórki. Kompleks ligand-receptor uruchamia określony proces. Receptory błonowe możemy podzielić na:

• jonotropowe (czyli kanały jonowe bramkowane przekaźnikami nerwowymi) - znajdują się w synapsach układu nerwowego oraz w komórkach mięśniowych, przekształcają sygnał chemiczny w elektryczny (zmieniaja potencjał transbłonowy)

• metabotropowe - współpracujące z białkami G

• katalityczne - związane z enzymami

Uaktywnione receptory metabotropowe i katalityczne przekazują sygnał dalej dzięki przekaźnikom II rzędu - są nimi 3'5'-cykliczne AMP, 3'5' - cykliczne GMP, 1,2-diacyloglicerol, 1,4,5-trójfosforan inozytolu oraz jon wapnia.

Receptory katalityczne:

• receptor będący kinazą tyrozynową: po dołączeniu liganda 2 receptory łączą się ze sobą i dzięki fosforylują się nawzajem - stają sie aktywne i moga fosforylować grupy tyrozynowe innych białek. Receptory takie łączą się m.in. z czynnikami wzrostu i insuliną!!!

• receptor będący cyklazą guanylową: powoduje powstawanie cGMP

• receptor będący fosfatazą tyrozynową: odcina grupę fosforanową od tyrozyny

• receptor będący kinazą serynowo-treoninową - zbudowany z 2 połączonych na stałe podjednostek, które po połączeniu z ligandem fosforylują się nawzajem: fosforyluje grupy serynowe i treoninowe innych białek.

Mechanizm aktywacji białka G:

Receptory współpracujące z białkiem G zbudowane są z białka 7-krotnie przeplecionego przez błonę komórkową (podobną budowę ma np. rodopsyna i receptory zapachu). Samo białko G zbudowane jest z 3 podjednostek: alfa, beta i gamma. W stanie niewzbudzonym podjednostka alfa związana jest z GDP. Receptor po połączeniu z ligandem zmienia konformację tak, że zmusza białko G do odrzucenia GDP i przyłączenia GTP. Wtedy rozpada się ono na 2 części: podjednostkę alfa i kompleks podjednostek beta-gamma - mogą one swobodnie dyfundować wzdłuż błony i oddziaływać z celami w błonie komórkowej (np. cyklazą adenylową, fosfolipazą C, kanałami jonowymi...). Podjednostka alfa ma charakter GTPazy i po pewnym czasie hydrolizuje GTP do GDP, wtedy podjednostki znowu łączą się (sygnał sam się wyłącza - ale np. toksyna cholery sprawia, że GTP nie hydrolizuje!).

W organizmie znajdują sie receptory związane z białkiem G aktywne w zasadzie przez cały czas (takie, jak receptory glukagonu, ACTH i epinefryny). Do zatrzymania działania cyklazy adenylowej potrzebne jest wtedy działanie odpowiedniego inhibitora (np. prostaglandyny i adenozyny). Odpowiednie białko G łączy sie wtedy z efektorem i hamuje jego działanie.

Mechanizm działania cAMP:

cAMP (przekaźnik II rzędu) łączy się z kinazą białkową zależną od cAMP która ma 2 podjednostki regulatorowe i 2 podjednostki katalityczne. kiedy cAMP przyłącza się do podjednostek regulatorowych, kompleks rozpada się i podjednostki katalityczne stają się aktywne. Kinaza jest enzymem dołączającym grupy fosforanowe pochodzące z hydrolizy ATP do AMP.

Jedno z białek G bierze też udział w procesie widzenia. W komórkach siatkówki znajduje się białko rodopsyna zbudowane z opsyny oraz retinalu (lipid, pochodna witaminy A). Pod wpływem niewielkich nawet ilości światła retinal zmienia swoją konfigurację i powoduje wymianę cząsteczki GDP na GTP w transdukcynie (jedno z białek G). Jej podjednostka alfa aktywuje fosfodiestrazę cyklicznego GMP (cGMP -> GMP), i dalej kaskadę sygnalizacyjną. Powoduje ona zamknięcie kanałów jonowych, zmianę potencjału i impuls nerwowy do mózgu. Sygnał jest bardzo mocno wzmacniany (amplifikowany) - dzięki temu oczy moga przystosowywać sie do ciemności.

Działanie receptora insulinowego:

Receptor insulinowy zbudowany jest z 2 podjednostek alfa i 2 transbłonowych podjednostek beta (połączone są wiązaniami dwusiarkowymi dzięki cysteinie). Podjednostka alfa łączy się z insuliną, zaś po wewnątrzkomórkowej stronie podjednostki beta znajduje sie motyw kinazy tyrozynowej.

Połączenie się receptora z insuliną powoduje wzajemną fosforylacje jej kinaz tyrozynowych. Kinazy te fosforylują następnie białko IRS1, które przyłącza sie do białka GRB2, ono przyłącza się do białka Sos, a białko Sos łączy się z białkiem Ras itp. (patrz działanie czynników wzrostu).

Insulina reguluje intensywność transportu glukozy do komórki. W błonie znajdują sie transportery glukozy, jednak znacznie więcej jest ich w pęcherzykach wewnątrz komórki. Gdy nie ma insuliny, pęcherzyki znajdują się w cytoplazmie i transportery w nich sa nieaktywne. Połączenie insuliny z receptorem powoduje włączanie pęcherzyków do błony i uaktywnianie znajdujących się w nich transportery glukozy (więcej transporterów - więcej glukozy dostaje sie do komórki). Po usunięciu insuliny ze środowiska błona z receptorami wpukla sie tworząc pęcherzyki.

Motyw kinazy tyrozynowej mają też białka FAK i SRC związane z płytką przylegania (m.in. z integrynami), oraz cytokiny (odbierające informacje prowadzące do podziału komórki). Ligandem jest tu interferon (IFN). Receptor przyłącza i fosforyluje 2 białka JAK, które fosforylują białka STAT (czynniki transkrypcyjne). 2 połączone białka STAT dostają się przez pory do jądra i uruchamiaja transkrypcję.

Działanie czynników wzrostu:

Receptory czynników wzrostu (np. EGF = naskórkowy czynnik wzrostu, PDGF = płytkowy czynnik wzrostu) posiadają w części zewnątrzkomórkowej domeny bogate w cysteinę, a wewnątrz komórki motyw kinazy tyrozynowej (RTK). Po połączeniu sie z ligandem 2 identyczne podjednostki łączą się ze sobą i następuje autofosforylacja kinaz, które stają się aktywne.

Grupy fosforanowe RTK łączą się z grupami SH2 białka GRB2, które po drugiej stronie ma 2 grupy SH3 łączące sie z białkiem Sos (jedno z białek GEF - albo odwrotnie...). Białko to powoduje aktywacje białka Ras. Aktywny Ras łączy się z kinazą serynowo-treoninową Raf. Raf fosforyluje kinazę MEK, która z kolei fosforyluje kinazę MAP. Dalej - kaskada kinaz, uaktywnianie czynników transkrypcyjnych itp...

Aktywacja i dezaktywacja białka Ras

Białko Ras jest jednym z białek G, ale zbudowanym z tylko 1 podjednostki (wg Albertsa, bo zdaniem prof. M. z podjednostek alfa, B i G). Ras w formie nieaktywnej połączone jest z GDP. GEF (guaninbe nucleotide-exchange factor) wymienia GDP na GTP i aktywuje białko. Dezaktywacja następuje poprzez defosforylację przez GAP.

Działanie fosfolipazy C:

Białko G aktywować może także fosfolipazę C produkującą inne przekaźniki II rzędu. Rozkłada ona fosfatydyloinozytol znajdujący się w cytoplazmatycznym listku błony, na diacetyloglicerol DAG (pozostający w błonie) i 1,4,5-trójfosforan inozytolu IP3 odłączający się do cytoplazmy. DAG łączy się z kinazą C (w błonie), zaś IP3 wiąże się z kanałami wapniowymi w ER i otwiera je. Jony Ca także oddziałuja na kinazę C (jest ona więc aktywowana przez 2 przekaźniki). Istnieje 12 różnych kinaz C - moga być specyficzne tkankowo.

Rola jonów wapniowych:

Jony wapniowe gromadzone są w ER. Uwalniane są do cytozolu przez:

• kanały reagujące na IP3

• receptor dihydropirydynowy aktywowany przez napięcie w mięśniach szkieletowych, przekazuje on sygnał receptorowi ryanodinowemu w siateczce sarkoplazmatycznej, a on wypuszcza jony na zewnątrz

• W mięśniach gładkich otwiera się kanał wapniowy, wapń dostaje się do środka i aktywuje receptor ryanodinowy.

Jony Ca związane są z kalmoduliną!

Wykład V: Budowa jądra komórkowego

Ścieżki przekazywania informacji w komórce:

• ścieżka Ras (środowisko-komórka-jądro) - patrz wykład IV. Każde jej zakłócenia może spowodować nowotwór, gdyż wpływa ona na regulacje podziałów i różnicowania komórki. Prawidłowe komórki mają wyłączoną ścieżkę Ras (chyba, że w środowisku znajduje się czynnik wzrostu).

• ścieżka Ran (cytoplazma-jądro) - zasada działania podobna do ścieżki Ras

• uwarunkowania historyczne - zależne od historii komórki, np. jej różnicowania (np. w kolejnych stadiach rozwojowych erytrocytów zawęża się program rozwoju linii komórkowej).

Budowa DNA:

Genom - zestaw całej informacji genetycznej. Zespół cząsteczek DNA (1 cząsteczka = 1 chromosom). Każda komórka diploidalna (większość organizmów zaawansowanych ewolucyjnie) ma 2 kopie każdego chromosomu: od ojca i od matki (chromosomy homologiczne).

Cząsteczka składa się z 2 komplementarnych łańcuchów polipeptydowych. Są one spolimeryzowane - mają koniec 3' i 5', co umożliwia kierunkowość odczytu informacji. Polimeraza DNA odczytuje nić w kierunku od 5' do 3'. Podwójna helisa jest stabilna dzięki wiązaniom wodorowym między komplementarnymi zasadami (A-T i C-G). Nukleotydy połączone są przez cukry (dezoksyrybozę w DNA lub rybozę w RNA) i fosforany - cukry i fosrorany tworzą rdzeń cząsteczki, a zasady "sterczą" do środka i tworza wiązania między nićmi.

Wyspecjalizowane sekwencje DNA:

• miejsce inicjacji replikacji OR (origin of replication) - miejsca rozpoznawane przez t-antygen (wrażliwe na kinazy związane z regulacją cyklu wzrostu), przyłącza szereg białek (fosfataz białkowych) zapobiegających niekontrolowanej replikacji. W genomie bakterii jest tylko 1 OR, u eukariotów - wiele (człowiek - 10000).

• centromer - zawiera sekwencje mające powinowactwo do białek akceptorowych łączących się z białkmi kinetochoru (umożliwia przyłączanie mikrotubul podczas podziału komórki).

• telomer - końce chromosomów zawierają powtarzające się sekwencje - umożliwiają prawidłowe funcjonowanie komórki po kilku cyklach replikacyjnych (w których końcówki są "niedorabiane") i chronią przed strawieniem.

Na końcu nici nie ma miejsca na OR, kawałek nie zostaje zreplikowany. Enzym telomeraza ma część informacyjną o charakterze RNA, podłącza się do niedoreplikowanego końca i przepisuje informacje z RNA na DNA (wiele kopii tej samej sekwencji). Na tak przedłużonej nici może powstać starter i niedoreplikowany zostaje tylko kawałek sekwecji powtarzalnej. telomeraza ma ograniczona aktywność - np. u ssaków działa tylko podaczas rozwoju zarodkowego, potem replikacje skracaja telomery (przyczyna starzenia się komórek) - wyjątek stanowią nowotwory, w których telomeraza ulega wtórnej aktywacji). Jedyny przypadek, gdzie RNA stanowi matrycę dla DNA (telomeraza jest odwrotną transkryptazą)!

• miejsca przyczepu do lamin jadrowych

• organizatory jąderkowe (rDNA) - miejsca kodujące rRNA. Widoczne, bo wokół nich gromadzi sie wyprodukowane rRNA. Podjednostki rybosomów "składane" sa w jądrze (do rRNA dołączane są białka) i dopiero wtedy transportowane do cytoplazmy przez pory jądrowe. W jąderku znajduje sie fosfataza cdc14 potrzebna do funkcjonowania wrzeciona podziałowego (podczas mitozy przechodzi do kinetochorów, a zawartość jąderka rozprasza się w cytoplazmie - łącznik pomiędzy rozpuszczaniem otoczki jądrowej a tworzeniem wrzeciona).

• rozrzucone sekwencje kodujące tRNA

Tylko prawidłowa, stabilna helisa może reagować z białkami i podlegać replikacji. Uszkodzona nić moze podlegać wycinaniu i replikowaniu na podstawie nici komplementarnej. Możliwa też jest wymiana pojedynczego nukleotydu, ale to może powodować mutacje w przypadku błędu). Sprawdzanie i korekta prawidłowości DNA jest konieczne dla funkcjonowania organizmu!

"Zawartość" DNA:

• 
  

sekwencje zasad kodujących (ORF = open reading frame) - ok. 10% informacji genetycznej. Na ich bazie powstaje RNA. Poprzedzone promotorami. W obrębie promotora znajduje się TATA box - miejsce rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne, oraz sekwencje wiążące polimerazę RNA.

• 2 systemy sekwencji kontrolnych - enhansery i silansjery - do nich przyłączają się białka regulatorowe. Mogą znajdować się w znacznej odległości od genu, żeby mogły działać, DNA musi utworzyć pętlę umożliwiającą kontakt aktywatorów z czynnikami transkrypcyjnymi i polimerazą.

• sekwencje niekodujace:

• repetytywne - potrzebne, żeby promotor i części regulatorowe mogły się spotkać <LI>wstawkowe (transpozony)- podatne na wycinane przez DNAzę, mogą być potem wstawiane w inne miejsca genomu - możliwość manipulacji genetycznych!

• "śmieciowe" (junk DNA) - nie zostały wyrzucone w trakcie ewolucji, gdyż nie były uszkodzone, a tylko przestały być potrzebne (albo nie odkryliśmy, że do czegoś służą...).

Budowa chromosomu interfazowego:

U eukariotów DNA w interfazie ma charakter chromatyny: kompleksu DNA i białek. Sekwencje kodujące są rozsupłane na tyle, że może zachodzić transkrypja.

Upakowanie DNA:

• nić nawinięta jest na rdzenie z histonów - małych białek z dodatnio naładowanymi aminokwasami wiążącymi się ze szkieletem cukrowcowo-fosforanowym (oktamer tworzą po 2 histony H2A, H2B, H3 i H4). Na każdym nukleosomie znajduje się 146 par zasad (nić nawinięta 1,75 razy), w DNA łącznikowym około 50 par zasad. Nukleosomy sa fazowane, tzn. poszczególne sekwencje genu musza być nawinięte w określonym miejscu nukleosomu (regulowane jest to przez system białek przesuwających ISWI).

• soleniod (coiled coil) - włókna o średnicy ok. 30 nm, DNA zwinięte jest w spiralę, w której wnętrzu znajdują się histony H1 linkery).

• solenoid uporządkowany jest w pętle (supercoil) - składniki włókien chromatydowych. U podstawy znajduje sie rdzeń białkowy (scaffold), do którego DNA przyłączone jest sekwencjami SAR. W skład włókien chromatynowych wchodza też enzymy, np. topoizomeraza II rozplatająca zbyt zwiniętą nić DNA

• Euchromatyna: średnica ok. 300 nm, słabiej zespiralizowana. Sekwencje często odczytywane. Heterochromatyna: sekwencje nie odczytywane (np. centromerowe i telomerowe).

Nawijanie i skręcanie DNA ma charakter pasywny (chromosom przyczepiony do lamin jądrowych i rdzenia białkowego -> miejsca SAR), lub dynamiczny - niektóre białka wiążące mają powinowactwo do białek motorycznych mogących zwijać / rozwijac DNA.

Białka strukturalne chromatyny: topoizomeraza II, białka SMC (struktual maintenance of chromosome)... Modyfikatorem splecenia chromatyny jest HAT (histon acetylate transferaze?) - ma on zdolnośc do acetylacji histonu H3 - ułatwia to dostępność dla transkrypcji. HAT przesuwa sie z nukleosomu na nukleosom, acetyluje całe regiony, aż trafi na czynnik transkrypcyjny, który go stabilizuje. Dostęp dla białek towarzyszących transkrypcji umożliwia białko SWI i ISWI.

Pomiędzy molekułami DNA moga tworzyć sie wiązania (charakterystyczne dla euchromatyny ciałka PCG = Polycomb granuls).

2 zreplikowane nici utrzymywane są razem przez kohezyny - białka wychwytywane w czasie replikasji z soku jądrowego. W chromosom inkrustowana są też kondensyny.

W jądrze znajdują się plamki jądrowe (nuclear specles) - miejsca do procesowania pierwotnego transkryptu (np. wycinania intronów).

Budowa jądra:

Jądro to przedział komórkowy, w którym znajduje się ogramna większość informacji genetycznej (trochę jest też w mitochondriach i plastydach). Otoczone jest podwójną otoczką jądrową (2 współśrodkowe błony): jej błona zewnętrzna ma taką samą budowę jak ER i pozostaje w ciągłości z nim, a wewnętrznaj znajdują się miejsca przyczepu dla chromosomów i lamin.

Jądro komunikuje się z cytoplazmą przy pomocy porów jądrowych. Zbudowane są one z tworzących pierścień białek zwanych nukleoporynami. Na zewnątrz znajdują się włoski mające charakter sensorów, a wewnątrz koszyk mogący wpuścić lub nie daną cząsteczkę. W porach znajdują się kanały, przez które mogą swobodnie przemieszczać się małe, hydrofilowe cząsteczki.

Duże cząsteczki, takie jak białka, wymagają specjalnego mechanizmu przechodzenia przez por. Białka mające dostać się do jądra muszą mieć sygnał lokalizacji jądrowej NLS (nuclear localization signal). Do takiej sekwencji aminokwasów przyczepia sie białko zwane receptorem importu jądrowego (karioferyna). Kompleks rozpoznawany jest przez sensory poru jądrowego i wciągany do srodka (na koszt GTPazy Ran). W jądrze receptor importu jądrowego odłącza się i przez por wraca do cytoplazmy (połączony z cząsteczkami mającymi sygnał eksportu jądrowego NES).

Do jadra dostaja się w pełni sfałdowane (!) białka z odsłoniętą sekwencją NLS (inaczej nie łączą się z karioferynami - sposób na regulację!). W ten sposób następuje przekazanie sygnału przez np. ścieżkę Ras (odpowiednia kinaza może dostać sie do jądra i uruchomić transkrypcję danego genu). Ścieżka może byc wyłączana przez łagodną proteolizę białek (usunięcie NLS powoduje inaktywację procesów jądrowych).

Z jądra przez pory wydostają się karioferyny, tRNA, mRNA oraz całe podjednostki rybosomów (rRNA z białkami).

W jądrze oprócz DNA znajduje się macierz jądrowa zbudowana z nukleoplazmy oraz wielu różnych białek, m.in. enzymów regulujacych replikację, transkrypcję i syntezę pre-rybosomów, czynników trankrypcji, białek modelujących DNA (SWI, ISWI). W jądrze znajduja sie też miejsca do modyfikowania pierwotnago transkryptu (spliceosomy).

Funkcje jądra: (z kserówki; moim zdaniem mocno pokręcone...)

• semikonserwatywne odtwarzanie struktury i zawartości informacyjnej chromatyny (replikacja).

• Regulowanie biosyntezy w innych przedziałach komórki:

• enzymy i czynniki regulujące powstawanie rRNA na terenie jąderka

• enzymy i czynniki transkrypcyjne TF regulujące transkrypcje mRNA

• enzymy i czynniki regulujące powstawanie tRNA

• enzymy i TF innych typów RNA

• wytworzenie i podtrzymanie funkcji otoczki jądrowej,

• regulacja lokalizacji jądra w komórce

• regulacja przebiegu mitozy i położenia wrzeciona kariokinetycznego

Wykład VI: Replikacja, transkrypcja, translacja

Replikacja:

Warunki inicjacji replikacji i kontrola przejścia G1/S:

• destabilizacja nukleosomu (częściowa proteoliza)

• aktywacja T antygenu w OR (origin of replication), interakcja z SWI, ISWI (białka modyfikujące strukturę DNA) i helikazami (białka rozplatające helikalną strukturę DNA).

• aktywacja CDK2 (jednej z cyklinozależnych kinaz, z cyklina A tworzy SPF = Sinthesis Promoting Factor) i inaktywacja inhibitora p21 (blokuje T antygen, czyli białko reagujące z OR) stymulowanego aktywnością białka p53 (antyonkogen, nie pozwala na aktywację białek doprowadzających do podziału komórki wtedy, gdy zachodzą błędy w strukturze DNA - gdy jest ich za dużo, komórka ulega apoptozie, czyli "programowej" śmierci). Inhibitorami SPF są również białka p16 / p18 zależne od ścieżki Ras!

Mutacja p53, retinoblastomy, MDM -> onkogeneza!

Działanie białka p53:

• powoduje syntezę białka p21, którew blokuje replikację

• hamuje działanie białka MDM (inhibitor aktywności p53)

• aktywacja BAX (czynnika apoptozy, który wraz z MYO powoduje aktywację kaspaz)

Geny kontrolujące przemienność faz sDNA i M:

• rum 1 - kontrola przejscia G1/sDNA: bez tego genu komórka wchodzi w mitozę bez replikacji; jego nadekspresja powoduje kolejne replikacje bez mitoz (a więc prowadzi do poliploidii)

• cdc 18 - brak powoduje przedwczesne wchodzenie w replikację, nadekspresja - poliploidyzację

• cdc 13 (produkcja cykliny B) - mutacja powoduje brak MPF (brak mitoz) i poliploidyzację

• cdc 20 - prtokinaza, powoduje aktywację cdc25 (a on aktywuje MPF)

• pds 1 - kontroler przejścia met/ana (precocios dissociation of sister chromatids)

• APC - kontroler równowagi napięć w płytce metafazowej, regulowany przez MPF (fosforylacja przez cdc27), inhibicja przez rum 1, degraduje pds 1 i cykliny. składa się z cdc34, cdc27, cut 4p, kuliny cdc 4 i cdc 53 oraz z proteasomów.

Mechanizm kontrolny zapobiegający pulweryzacji reguluje:

• wejscie w fazę sDNA (rozpoczęcie replikacji) - s-phase checkpoint

• niezakłócony przebieg całej jednorazowej replikacji genomu (dzięki ORC = origin replication complex, czyli licencji do replikacji DNA, dołączonej przed replikacją do wszystkich replikonów) - demage checkpoint i topo II checkpoint

• w trakcie replikacji do chromatyny przyłączane są kondensyny (smc1 / smc3) i kohezyny (scc1 / scc3) - zapewniaja one łączność chromatyd po replikacji

• w przypadku pojawienia sie wolnych końców nici DNA (powstają przejściowo w wyniku aktywacji topoizomeraz rozcinających nici i łączących je tak, żeby były mniej skręcone w trakcie syntezy DNA; generalnie jest to sygnał nieukończonej replikacji) aktywowana jest kinaza alarmowa ATM wstrzymująca przejście metafaza / anafaza

• przejście met / ana wiąże się z aktywacją łagodnej proteolizy proteasomowej przez aktywację APC cdc20 (anaphase promoting complex).

Aktywacja replikacji DNA:

• aktywacja kopleksu CDK 4/6 + cyklina D

• fosforylacja białka retinoblastoma (Rb; też antyonkogen), powoduje unieczynnienie białka p53 i uwolnienie p21 z T antygenu oraz aktywację transkrypcji białek, syntezę cykjliny E i jej aktywację.

• SPF fosforyluje T antygenu na kluczowej treoninie

• PP2A defosforyluje T antygen na kluczowej serynie

• Rozpoczęcie replikacji (ssaki): podłączenie helikazy TOP1, polimerazy PCNA, polimerazy gamma, prymazy RNA, białka destabilizacji, wyciszacza primera RNA, ligazy...

• Podłączane są kohezyny CSS 1/3 i kondensyny SMC 1/3 (białka mające za zadanie łączyć 2 nici DNA), następuje remodelowanie chromatyny.

• podłączenie CDK + cdc45 - inicjacja replikacji!

Przebieg replikacji:

• W miejscach OR rozplatanie nici przez topoizomerazę II i helikazę. Nić rozpleciona stabilizowana jest przez białka SBB.

• Powstają widełki replikacyjne. Prymaza syntetyzuje krótki fragment RNA służący jako starter.

• Aparat replikacyjny:

1. helikaza przesuwa się wzdłuż DNA i rozplata helikalną strukturę (ATP -> ADP). Oddziela od siebie nici.

2. białka SBB wiążą jednoniciowy DNA i zapobiegają ponownemu łączeniu się nici.

3. Przed polimerazą DNA znajduje się ruchoma obręcz, która tworzy pierścień wokół DNA i wiąże polimerazę, umożliwiając jej ruch wzdłuż matrycy. Na nici opóżnionej uwalnia DNA po każdym zakończeniu fragmentu Okazaki.

Polimeraza DNA katalizuje przyłączanie nukleotydów do łańcucha (dobudowuje od 5' do 3'!!!).

Łańcuch na nici wiodącej biegnącej od 3' do 5' dobudowywany jest w sposób ciągły, zaś na drugiej nici (opóźnionej) - w sposób nieciągły (powstają tzw. fragmenty Okazaki).

Do rozpoczęcia dobudowywania (w OR i na początku każdego fragmentu Okazaki) potrzebna jest prymaza, która buduje krótki fragment RNA (tzw. starter). Budowa fragmentów Okazaki rozpoczyna się od startera i kończy na poprzednim).

Startery usuwane są przez nukleazę.

Naprawcza polimeraza DNA uzupełnia te miejsca.

Ligaza DNA łączy sąsiadujące ze sobą fragmenty.

Nić opóżniona zwinięta jest w ten sposób, że polimeraza tworzy jeden kompleks z helikazą i prymazą.

Polimeraza DNA ma zdolnośc do autokorekty (redagowania) - po każdym wbudowaniu nukleotydu sprawdza, czy jest on prawidłowy. Jeśli nastąpił błąd, usuwa go (aktywność nukleazy) i na jego miejsce wstawia następny.

Transkrypcja:

Rodzaje RNA:

• mRNA - stanowi "matrycę" do produkcji białek

• tRNA - W procesie biosyntezy białka pośredniczy między mRNA a aminokwasami w odczytywaniu kodonów (trójek kodujących określony aminokwas)

• rRNA - wraz z białkami tworzy rybosom, uczestniczy w syntezie białka

• snRNA (small nuclear RNA) - uczestniczą w splicingu pre-mRNA, transporcie białek do ER i innych procesach.

 tRNA, rRNA i snRNA nie podlegają translacji! (ale w niej uczestniczą).

Gen - zespół lub kombinacja odcinków DNA, które tworzą jednostkę ekspresji (jednostkę umożliwiającą utworzenie specyficznego, funkcjonalnego produktu ostatecznego w postaci cząsteczki RNA lub polipeptydu). W obrębie genu znajdują się: promotor, jednostka transkrypcyjna, terminator i sekwencje regulatorowe. U Procaryota w obrębia genu znajdują się wyłącznie sekwencje kodujące, u Eucaryota powstające mRNA musi zostać odpowiednio zmodyfikowane przed "użyciem".

Transkrypcja przebiega zawsze od 5' do 3'. Promotory są asymetryczne, więc zawsze brana jest pod uwagę ściśle określona nić.

Przebieg transkrypcji u bakterii:

• Cząsteczka polimerazy RNA asocjuje się z cząsteczką DNA i przesuwa się po nim, aż napotka miejsce promotorowe (zawiera sekwencje stanowiące informację o miejscu startu transkrypcji), z którym tworzy silny kompleks.

• Po utworzeniu kompleksu polimeraza RNA rozplata DNA, jedna z nici staje sie matrycą, rozpoczyna się synteza komplementarnego RNA.

• Wydłużanie następuje aż do sekwencji terminacji (stop) - wtedy polimeraza uwalnia DNA i RNA.

Przebieg transkrypcji u Eucaryota:

• Rozplecenie krótkiego odcinka dwuniciowej helisy DNA - konieczne jest remodelowanie jej struktury. Histony H3 muszą zostać zacetylowane przez HAT (enzym ten przesuwa się po DNA, acetyluje histony aż do chwili, gdy trafi na kompleks towarzyszący promotorowi).

• .W obrębie promotora znajduje się TATA box (miejsce bogate w adeniny i tyminy), które rozpoznawane jest przez czynnik transkrypcyjny TF II D. Obok przyłączają się pozostałe czynniki transkrypcyjne i polimeraza RNA. Czynniki transkrypcyjne mają za zadanie prawidłowo "ustawić" polimerazę RNA, pomagaja w rozdzieleniu 2 nici i uwalniaja ją z promotora w momencie rozpoczęcia transkrypcji.

• Istnieją sekwencje, które wiążą się z białkami regulatorowymi (represorami hamującymi transkrypcję lub aktywatorami powodującymi ją). Wiążą się one ze specyficznymi sekwencjami DNA (silansjerami i enhanserami), które mogą znajdować się daleko od promotora - DNA tworzy pętlę, dzięki której oddziaływują one z kompleksem czynników transkrypcyjnych i polimerazy RNA. Białka regulatorowe działają w zespołach (kontrola kombinatoryczna) - np. brak jednego z wielu powoduje brak transkrypcji, a 1 inhibitor może hamować wiele procesów.

• W obecności wszystkich potrzebnych białek jeden z czynników transkrypcyjnych fosforyluje polimerazę. Wtedy enzym uwalnia się z kompleksu i rozpoczyna trankrypcję.

• Powstaje fragment RNA połączonego z DNA (ale szybko się odłącza). W efekcie trankrybowany DNA wygląda jak choinka (bo proces zachodzi w wielu miejscach).

Dojrzewanie pre-mRNA:

• W wyniku transkrypcji powstaje RNA zawierające zarówno sekwencje kodujące (eksony), jak i niekodujące (introny) - transkrypt pierwotny.

• Modyfikacja końca 5' - powstawanie tzw. czapeczki (7-metyloguanozyna na początku transkryptu).

• Modyfikacja końca 3' - powstawanie ogona poliA (poliadenylacja, osłania to ostatnie sekwencje). Za kodonem stop znajdują się sekwencje informacyjne (3' UTR = untraslated region), mogą mieć powinowactwo np. do białek motorycznych (dzięki temu mRNA może byc transportowany do określonych miejsc w komórce i dopiero tam powstaja białka).

• Splicing - usuwanie intronów odbywa się w specles. Introny zawierają krótkie sekwencje będące sygnałami do ich usuwania. Dołącza się kompleks białek i snRNA (snRNP = small nuclear ribonucleoprotein). Fizycznie zbliżają one do siebie końce intronów, tworzą z niego "lasso", które odpada i ulega degradacji. Końce eksonów łączą się. RNA działa jak enzym!!! Eksony mogą źle się złożyć - to jeden z mechanizmów ewolucji! Z tego samego genu w zależności od warunków (np. typu komórki) mogą powstawać różne białka (alternatywny splicing).

• Inne modyfikacje (delecje, przegrupowania...)

• Gotowe, dojrzałe mRNA może ulec translacji.

• Dzięki istnieniu odwrotnej transkryptazy mozna "przepisać" mRNA na DNA. Jest to bardzo przydatne w warunkach labolatoryjnych, gdyż otrzymujemy DNA zawierające wyłącznie regiony kodujące (cDNA).

Splicing rRNA:

Sekwencje kodujące poszczególne rodzaje rRNA stanowią zawsze fragmenty tego samego genu i ułożone są zawsze w tej samej kolejności: 18s rRNA, 5,8s rRNA i 25s rRNA. W wyniku transkrypcji powstaje pierwotny transkrypt 35s, z którego kolejno wycinane są sekwencje niekodujące.

Polimerazy RNA:

• polimeraza I - bierze udział w transkrypcji rRNA w jąderku.

• polimeraza II - transkrypcja mRNA podlegającego translacji i bogatego w uracyl U-RNA (to samo, co snRNA) biorącego udział w wycinaniu intronów

• polimeraza III - tRNA, U6-RNA, 5sRNA - małe RNA uczestniczące w transporcie i translacji.

Translacja:

Przebieg tranlacji:

• mRna transportowane jest do cytoplazmy przy pomocy białek motorycznych dołączonych do sekwencji 3' UTR

• Na terenie cytoplazmy łączą się 2 podjednostki rybosomalne (mała i duża), 5sRNA i mRNA (przyczepione sekwencją starterową - kodonem inicjującym AUG kodującym metioninę). U Eucaryota potrzebne są do tego czynniki inicjujące.

• Do tego kompleksu przyłącza się tRNA z odpowiednim aminokwasem. tRNA ma kształt koniczynki, która na górze ma antykodon, czyli miejsce mające powinowactwo do trójki nukleotydów mRNA kodujących określony aminokwas oraz miejsce akceptorowe na końcu 3' przyłączające aminokwas odpowiadający sekwencji nukleotydów.

• Rybosom zawiera 4 miejsca wiązania RNA: jedno dla mRNA i 3 dla tRNA (A = aminoacylo-tRNA, P = peptydylo-tRNA, E = exit). Pierwszy tRNA przyłącza się w miejscu A i przesuwa się na miejsce P.

• Do zwolnionego miejsca A przyłącza się kolejny tRNA. Wtedy karboksylowy koniec łąńcucha peptydowego / aminokwasu przenoszony jest z tRNA w miejscu P na tRNA w miejscu A (dzięki peptydylotransferazie tworzy z aminokwasem wiązanie peptydowe).

• Jest to sprzężone z przesunięciem się podjednostek względem siebie - wtedy wolne tRNA przesuwa się z P na E, a tRNA z peptydem - na miejsce P.

• Mała podjednostka przesuwa się o 3 nukleotydy (wraca do pozycji wyjściowej), tRNA z miejsca E opuszcza rybosom. Cykl rozpoczyna się na nowo.

• Powtarza się to do chwili, aż w miejscu A znajdzie się kodon stop (UAA, UAG, UGA). Z sekwencją tą wiążą się czynniki uwalniające (białka), które zmieniają aktywność peptydylotransferazy (uwalnia białko do cytoplazmy). Wtedy rybosom uwalnia mRNA i rozpada się na podjednostki.

Wykład VII: Losy białek w cytoplazmie

Losy białek w cytoplazmie:

Białka cytoplazmatyczne:

• Białka, których miejscem przeznaczenia jest cytoplazma, produkowane są wprost do niej. Już podczas syntezy wchodza w kontakt z chaperonami (tworzącymi "beczułkę chaperoninową"), które chronią je przed strawieniem i wymuszają odpowiednie sfałdowanie (konformację).

• Fałdowanie może też nastąpić samoistnie lub przy udziale innych białek (np. białka linearne mogą formować się w białkach o kształcie rynienki, mogą dopasowywać się jak puzzle lub skręcać naokoło siebie). Kompleksy białkowe mogą tworzyć się przy pomocy białka scaffold o kształcie grzebienia, w którym w odpowiedniej kolejności zlokalizowane są odpowiednie enzymy (może też służyć po prostu jako łącznik przestrzenny).

• Białka zlokalizowane w cytoplazmie, np. różne enzymy, zawierają tylko niewielką część katalityczną - reszta to sekwencje regulacyjne, zabezpieczające przed strawieniem, determinujące powinowactwo do innych struktur itp.

• Niektóre białka zawierają sekwencję NLS (nuclear localization signal) i transportowane są do jądra przez pory w otoczce.

• Białka mogą być też kierowane do mitochondriów i plastydów.

Przyczyny niszczenia białek:

• Białka nieudane, np. źle sfałdowane, podlegają poliubikwitynacji - do określonych aminokwasów (lizyn) dołączana jest ubikwityna, która "kieruje" białko do proteasomów.

• "Nieudane" białko:

• jest niewłaściwie sfałdowane

• ma zgrupowanie lizyn "na wierzchu"

• pierwszym aminokwasem jest metionina, seryna, treonina, alanina, walina, cysteina, glicyna.

• Proteosomy to cylindry z proteaz rozkładających białka. Zamykany jest kompleksem białkowym ("wieczkiem"). Białka przeznaczone do degradacji wciągane są do wnętrza cylindra (ale muszą mieć "sygnał" w postaci ubikwityny!).

Białka błonowe i pozostające wewnątrz pęcherzyków:

Nie wszystkie białka mogą swobodnie pływać sobie z cytoplazmie. Niektóre (np. enzymy proteolityczne) muszą zajmować określone kompartmenty i być oddzielone od reszty komórki, gdyż np. moga trawić potrzebne cząsteczki. Do umieszczania białek w we wnętrzu błony / pęcherzyka lub zakotwiczania ich w błonie służy tzw. kotranslacja.

Białka błonowe syntetyzowane są przez rybosomy przyczepione do szorstkiej siateczki endoplazmatycznej. Translacja rozpoczyna się, gdy połączą się obie podjadnostki rybosomu oraz mRNA. Zwykle pierwsza powstaje sekwencja sygnałowa o długości 21 aminokwasów. Do niej dołącza się peptyd sygnałowy SRP (cząsteczka rozpoznająca sekwencję; po przyłączeniu hamuje translację). Potrzebne jest też 7s RNA.

W błonie znajduje się receptor SRP, który wiąże SRP i rybosom (wtedy otwiera się w nim kanał translokacyjny). Sekwencja sygnałowa dostaje się do kanału translokacyjnego, wznowienie translacji, SRP wraca do cytoplazmy.

Syntetyzowany polipeptyd dostaje się do środka tworząc pętlę (bo sekwencja sygnałowa pozostaje w kanale). W pewnym momencie peptydaza sygnałowa (ze światła ER) odcina sekwencję sygnałową (wypada ona wtedy do cytoplazmy i ulega degradacji). Białko zostaje w ten sposób w świetle ER.

Białko może być przeplecione przez błonę raz lub kilka razy: wtedy w pewnym momencie pojawia sie sekwencja stop-transfer. Zostaje ona uwolniona z kanału poprzez jego boczne otwarcie i zakotwiczona w błonie (równocześnia odcinana jest sekwencja sygnałowa). Translokacja zostaje rozpoczęta ponownie przez sekwencję start-transfer itp. Po odcięciu peptydu sygnałowego białko pozostaje w błonie.

Rola aparatu Golgiego:

Aparat Golgiego jest systemem cystern i pęcherzyków. Jego główną rolą jest "segregacja" białek i ich modyfikacja (dodawanie grup węglowodanowych do przyszłych glikoprotein).

Od strony siateczki endoplazmatycznej znajduje się strona cis (CGN = cis Golgi network), wewnątrz cysterny, a od strony błony komórkowej strona trans (TGN = trans Golgi network). Pęcherzyki dostają się do aparatu Golgiego od strony cis, "przechodzą" przez cały aparat Golgiego i są wydzielane przez TGN. TGN jest fragmentem najbardziej pofałdowanym, tu właśnie następuje "sortowanie"produktów - np. tworzone są lizosomy z zamnkniętymi w nich enzymami proteolitycznymi.

Wszystkie pęcherzyki odpączkowujące od błon (nie tylko aparatu Golgiego) są opłaszczone (otoczone płaszczem białkowym z klatryny). Klatryna należy do triskelionów, tworzy siateczkę o układzie pseudokrystalicznym, układa się w kulę o określonej średnicy - nie pozwala na tworzenie dużych pęcherzyków.

Pęcherzyk powstaje jako dołek opłaszczony klatryną, uwypukla się, odcinany dzięki dynaminie (GTP -> GDP).

Płaszcz z błoną wiążą adaptyny - zawierają one sygnał transportu rozpoznawany przez receptory cargo w przedziale wyjściowym (umożliwia wychwytywanie odpowiedniego "ładunku" do transportu). Znajdują się też na nim białka COP (np. COP II kieruje do aparatu Golgiego).

Na powierzchni pęcherzyka znajdują się znaczniki molekularne V-SNARE (np. białka Rab?) niosące informację o tym, z czym ma się połączyć dany pęcherzyk (np. z lizosomem lub błoną komórkową). Fuzję powoduje połączenie się go z odpowiednim T-SNARE na powierzchni błony docelowej.

Endocytoza:

Pinocytoza (płyn i małe cząsteczki):

• cząsteczki wiążą się z receptorem na powierzchni komórki

• wnikają do środka jako kompleks z receptorem (tworzą się dołki i pęcherzyki opłaszczone klatryną)

• dzięki działaniu pompy wodorowej (H+ ATPazy) w środku środowisko kwaśne, które może spowodować odłączenie liganda od receptora)

• pęcherzyki zostają odpłaszczone i łączą się z miejscem przeznaczenia.

Fagocytoza (duże cząsteczki, szczątki komórkowe itp):

• Komórka wytwarza wypustki, którymi otacza cząstkę, tworzy się fagosom pierwotny.

• Fagosom pierwotny łączy się z lizosomem -> powstaje endosom = fagosom wtórny (zespół cewek i pęcherzyków, w środku środowisko kwaśne, następuje degradacja zawartości fagosomu).

Wchłanianie i transport przez błonę pęcherzyka strawionego materiału lub włączenie np. cholesterolu do ścianki pęcherzyka i odwodnienie (kurczenie sie pęcherzyka) lub mikropinocytoza (odłączanie się wtórnych pęcherzyków). powrót pęcherzyka do błony komórkowej, fuzja, uwolnienie niestrawionych resztek, powrót receptorów do stanu wyjściowego (bo zmiana pH).

Endocytoza receptorowa jonów żelaza:

• Jony Fe³⁺ (znajdujące się w osoczu krwi) łączą się z apotransferyną, tworząc ferrotransferynę.

• Ferrotransferyna połączona jest (trwale!) z receptorem znajdującym się w błonie (w jamce pinocytarnej).

• W chwili przyłączenia jonu tworzy się pęcherzyk opłaszczony klatryną.

• Dzięki pompie wodorowej w środku środowisko kwaśne, pH około 5,. Następuje odpłaszczenie, a żelazo redukuje się do Fe²⁺ i trafia do cytozolu.

• Oddzielają się pęcherzyki wtórne z apotransferazą związaną z receptorem. Egzocytoza, apotransferaza wraca do osocza.

Endocytoza receptorowa cholesterolu:

• LDL (low density lipoprotein) - liposom, pęcherzyk z fosfolipidów i cholesterolu, zawierający cholesterol związany z kwasami tłuszczowymi (zestryfikowany) i białko.

• Białko LDL łączy się z receptorem LDL (transbłonowy, w jamce opłaszczonej klatryną), wpukla się pęcherzyk (liposom).

• Zakwaszenie i odpłaszczenie pęcherzyka, połączenie z endosomem.

• Następuje hydroliza estrów cholesterolu i włączenie go do ścianki pęcherzyka.

• Pęcherzyk wraca do błony komórkowej, receptor LDL wraca na powierzchnię komórki

.

Wykład VIII: Losy komórek w organizmie

Kategorie komórek:

Losy komórek w organizmie determinowane są zarówno przez czynniki zewnętrzne (np. czynniki wzrostu), jak i wewnętrzne.

• Komórki "uśpione" w fazie G0, zdolne do ponownej proliferacji w określonych warunkach (komórki macierzyste).

• Komórki embrionalne - znajdujące się w fazie G1 i dzielące się pod wpływem lokalnych czynników wzrostu (receptory typu RTK = kinazy tyrozynowe)

• Komórki różnicujące się - po zróżnicowaniu niezdolne do proliferacji (różnicowanie się dzięki czynnikom różnicowania TGF i ich receptorom - kinazom serynowo - treoninowym -> czynniki transkrypcyjne -> nowe białka).

• komórki eliminowane na drodze apoptozy (samozniszczenia), np. komórki "błon" między palcami w rozwoju zarodkowym, pod wpływem układu odpornościowego, pod wpływem szlaków przewodzenia w układzie nerwowym...

Działanie czynników wzrostu:

Receptory czynników wzrostu (np. EGF = naskórkowy czynnik wzrostu, PDGF = płytkowy czynnik wzrostu) posiadają w części zewnątrzkomórkowej domeny bogate w cysteinę, a wewnątrz komórki motyw kinazy tyrozynowej (RTK). Po połączeniu się z ligandem 2 identyczne podjednostki łączą się ze sobą i następuje autofosforylacja kinaz, które stają się aktywne.

Grupy fosforanowe RTK (kinazy tyrozynowej) łączą się z grupami SH2 (SRC 2 domain) białka GRB2, które po drugiej stronie ma 2 grupy SH3 (SRC3 domain) łączące sie z białkiem Sos (jedno z białek GEF - albo odwrotnie...). Białko to powoduje aktywacje białka Ras. Aktywny Ras łączy się z kinazą serynowo-treoninową Raf. Raf fosforyluje kinazę MEK, która z kolei fosforyluje kinazę MAP. Dalej - kaskada kinaz (umieszczonych w białkach scaffold - synchronizacja działania), uaktywnianie czynników transkrypcyjnych itp...

Sygnalizacja w komórce:

• Na komórkę oddziaływują czynniki zewnętrzne powodujące zmiany aktywności enzymów (zwłaszcza kinaz i fosfataz), zmiany w cytoszkielecie, zmiany w programie transkrypcji genów i w szeregu innych funkcji.

• Czynniki o charakterze molekuł sygnalizacyjnych muszą połączyć się z odpowiednim receptorem w błonie lub cytozolu.

• Neurotransmitery związane są z kanałami jonowymi w błonie, wiele receptorów błonowych z enzymami, a czynniki wzrostu lub proliferacji z białkami G (ścieżka Ras).

• Receptory działające w cytozolu to m.in.:

• cyklaza guanylowa stymulowana przez NO (powoduje relaksację skurczu mięśnia)

• hormony sterydowe, hormon tarczycy, kwas retynowy, witamina D - działają na receptory inhibowane dotąd przez białko H sp 90 - powodują transkrypcję genów

• Ścieżka związana z białkiem G:

• receptory podwyższające poziom cAMP - np. receptory beta-adrenalgiczne ( wzrost stężenia cAMP aktywuje kinazę A, która powoduje aktywację ścieżki glikolitycznej - aktywacja syntazy glikogenu); komórki syntetyzujące somatostatynę - pozytywne sprzężenie (somatostatyna ma aktywowany przez cAMP region wiążący do DNA - CRE = cAMP response element; CRE rozpoznawany przez czynnik transkrypcyjny CREB, który ufosforylowany przez kinazę A stymuluje transkrypcję somatostatyny).

• receptory obniżające poziom cAMP - np. receptory hormonalne alfa-2-adrenergiczne - blokują cyklazę adenylową (spadek stężenia cAMP) lub otworzenie kanałów K+ i wygaszenie bodźca elektrochemicznego.

• Ścieżka związana z kinazą tyrozynową.

Regulacja cyklu komórkowego:

• Kontrola replikacji (checkpoint G1/S):

Inhibitorami kompleksu SPF (cdk 4/6 i cyklina D) są:

• białka p16 i p18 związane ze ścieżką Ras. Każda mutacja w tej ścieżce może prowadzić do nowotworu!!! (geny kodujące białka biorące w niej udział są protoonkogenami, które pod wpływem mutacji stają się onkogenami).

• białko p53 i związane z nim p21 (biorą udział w "sprawdzaniu" prawidłowości genomu i ewentualnym wstrzymaniu replikacji). Antyonkogeny!

• Białko retinoblastoma - wpływa na działanie białka p53 i p21 (fosforylacja retinoblastomy powoduje unieczynnienie p53 i uwolnienie p21 z T antygenu).

• Te 3 ścieżki muszą się zgadzać, dopiero wtedy dochodzi do replikacji.

• W fazie G1 działaja cykliny D i E ("włącza" syntezę DNA).

• W fazie S działa cyklina A (prowadzi do aktywacji cykliny B).

• Kinaza alarmowa ATM - kontroluje prawidłowość DNA.

• Kontrola wejścia w mitozę (checkpoint G2/M):

• MPF (mitosis promoting factor) - CDK1 i cyklina B.

• Musi zostać zdefosforylowany przez fosfatazę tyrozynową cdc25 (aktywowana przez polokinazę w potencjalnych biegunach wrzeciona). Inhibitorem cdc25 jest białko p53 aktywowane przez kinazę alarmową ATM (kontroluje, czy nie ma wolnych końców nici DNA wskazujących na niedokończoną replikację).

• Następuje degradacja cyklin D i E.

• Przełączenie z proteolizy SCF (ligaza ubikwitynowa, niszczy inhibitory cyklu i wczesne cykliny; powoduje nieodwracalność cyklu), na APC (anaphase promoting complex, który aktywuje inną ligazę (niszczącą MPF).

• Kontrola rozchodzenia się chromosomów (checkpoint ana/met):

• zmiana APC cdc20 na APC cdh1

• degradacja polokinazy i inaktywacja cdc25

• surwiwina - jej wędrówka z kinetochoru jest warunkiem prawidłowej cytokinezy; jest również inhibitorem kaspaz (zapobiega apoptozie).

• Cytokineza / G1:

• tworzenie ORC

• degradacja cykliny B

• Białka bub regulują uwalnianie fosfatazy ser/thr - defosforylacja CKI (?)

Warunki zaistnienia onkogenezy:

• Warunkiem koniecznym jest mutacja ścieżki Ras (np. receptora dla czynnika wzrostu, białka Ras, białka p16 i p18 -> powoduje ciągły sygnał do podziału), retinoblastomy i białka p53 (lub p21).

• mutacja kinazy alarmowej ATM (ma ją większość komórek nowotworowych).

• defekt w białku myc (związanym z czynnikiem apoptozy)

• defekt w cyklinie D lub innych cyklinach regulujących fazę S.

Apoptoza:

Apoptoza to śmierć komórki poprzez aktywację kaskady enzymów proteolitycznych (naczelna kaspaza ICE aktywuje kolejne) niszczących białka. Nie powoduje stanu zapalnego (bo nie zostaje mechanicznie zniszczona, po prostu "zapada" się i kurczy).

Sygnały powodujące wejście komórek w apoptozę:

• brak czynników wzrostowych

• uszkodzenie DNA (np. przez naświetlanie promieniowaniem UV, gamma, X)

• inhibitory topoizomeraz

• zewnętrzne antyoksydanty

• brak kontaktu komórki z podłożem lub jego modyfikacja

• pobudzenie receptorów przez cytokiny (ścieżka Fas) lub TNF

• pobudzenie uwalniania Ca2+ do cytozolu i aktywacja PKC

Istnieją 3 systemy wykonawcze:

• ujawnienie fosfatydyloseryny po zewnętrznej stronie błony komórkowej pod wpływem uwolnienia Ca2+ do cytozolu stanowi sygnał, że inne komórki powinny ją sfagocytować (układ odpornościowy)

• sygnały od innych komórek - szlak używany w rozwoju zarodkowym do niszczenia niepotrzebnych komórek i do degradacji inhibitorów TF w komórkach (aktywacja kinazy, która aktywuje proteolizę inhibitorów - powoduje wznowienie transkrypcji)

• pod wpływem stresu następuje wyłączenie proteasomów ("normalnych"), a włączenie systemu kaspaz, np. w w chorobach neurodegeneracyjnych, udarach mózgu...

Szlaki uruchamiające appoptozę:

Czynniki śmierci: ligandy decydujące o śmierci komórki - czynniki martwicy nowotworowej TNF (tumor necrosis factor), np. interleukiny, cytokiny - umożliwiają zniszczenie zmutowanych komórek. Receptory (TNFR):

• trimery - uruchamiają ścieżkę odporności

• sieroce (pojedyncze) - wychwytują TNF, ale nie przekazują dalej sygnału. Powodują, że komórka nie reaguje na małe ilości czynników (muszą się najpierw wysycić, zanim zostaną zaktywowane trimery).

• Uszkodzenie mitochondriów - przerwanie łańcucha oddechowego, nadprodukcja nadtlenków, brak ATP.

• Zmiany w cytoplazmie (np. aktywacja p21), zmiany w jądrze (retinoblastoma, p53, Myc).

Przebieg apoptozy:

• proteoliza mitochondriów (chroniące białko - BCl-2)

• cytoliza i proteoliza - aktywacja ICE

• degradacja jądra (nukleololiza i liza chromatyny)

Istnieją mechanizmy zabezpieczające przez zbyt łatwym wchodzeniem w apoptozę - surwiwina, białka BCL2 (inaktywują naczelne kaspazy)

Wykład IX: Chloroplasty

Chloroplasty znajdują się wyłącznie w komórkach roślinnych (w różnego typu miękiszu - nie ma ich w epidermie z wyjątkiem aparatów szparkowych).

Budowa chloroplastu:

Chloroplast to bryła otoczona 2 błonami (zewnętrzna zawiera poryny - kanały wodne przepuszczalne dla wody, jonów, małych cząsteczek; wewnętrzna zawiera przenośniki elektronów). Środek wypełnia stroma (zawiera wiele enzymów i skrobię) i stosy tylakoidów ułożonych w grana (ich wnętrza są ze sobą połączone). Chloroplast zawiera więc 3 przedziały: przestrzeń międzybłonową, stromę i światło tylakoidów.

Tylakoidy zespolone w grana i niezespolone (międzygranowe) różnią się składem błon!

Chloroplasty (i mitochondria) to organella semiautonomiczne - posiadają własny genom, ale jego pojemność jest zbyt mała (nie koduje wszystkich występujących w chloroplastach białek). DNA chloroplastowe zawiera około 130-140 genów, koduje około 10% białek. Większość jest kodowana przez jądro, syntetyzowana w cytoplazmie i transportowana na teren plastydu.

DNA chloroplastu:

• Pełna sekwencja DNA znana jest u 8 roślin lądowych (np. ryż, kukurydza, tytoń, sosna czarna, Psilotum, porostnica) i 6 glonów. W chloroplaście znajduje się 20-30 identycznych nukleoidów.

• Cząsteczka DNA jest kolista, zbudowana z 2 komplementarnych nici. Replikacja zewnętrznej następuje zgodnie z ruchem wskazówek zegara, wewnętrznej w drugą stronę.

• W DNA znajdują się 2 sekwencje niepowtarzalne kodujące białka (LSC = large single copy i SSC = small single copy) przedzielone dwoma sekwencjami IR = inverted repeat (sekwencje powtarzalne kodujące tRNA, rRNA i białka rybosomalne).

Geny rRNA ułożone są zawsze w tej samej kolejności (16s, 23s, 5s, 4.5s), pomiędzy nimi często tRNA.

• ekspresja genów często następuje pod wpływem światła - uaktywnia ono fotoreceptor, np. fitochrom (niebieski barwnik fitochromobilina + białko apoproteina, ma aktywnośc kinazy białkowej), kryptochrom (pochłania światło niebieskie).Fotoreceptor aktywuje białka regulatorowe trans (GBF, GT-I). Białka te uruchamiają transkrypcję mRNA, na podstawie którego syntetyzowane są białka chloroplastu (np. pSSU (pre-SSU) - mała podjednostka rubisco; w chloroplaście łączy się z LSU i tworzy enzym, pLHCP transportowany do tylakoidu).

DNA chloroplastowe zawiera:

• geny związane z aparatem genetycznym - czynniki inicjacji translacji; podjednostki polimerazy RNA; wszystkie tRNA; 4 rodzaje RNA; około 1/3 białek podjednostek rybosomalnych... Druga polimeraza jest całkowicie kodowana w jądrze.

• geny aparatu fotosyntetycznego:

• rbcL - koduje dużą podjednostkę rubisco (karboksylazy rybulozodifosforanu), małe podjednostki kodowane są przez genom jądrowy

• polipeptydy fotosystemów błon tylakoidów: psI - >psaA, psaB, psaC, psaI, psaJ; psII -> psbA-F, psbH, psbI, psbK-N

• 4 geny polipeptydów kompleksu cytb6/f -> cytb6, cytf, podjednostki IV i V. (reszta w jądrze)

• 6 podjednostek syntazy ATP (F1:alfa, beta, eta, F0: I, III, IV).

• podjednostki dehydrogenazy NADH

Cechy struktury genomu i jego ekpresji:

• Obecność intronów w wielu genach (cecha typowa dla komórek eukariotycznych!)

• Kod genetyczny identyczny z uniwersalnym (w przeciwieństwie do mitochondrialnego)

• Replikacja chloroplastowego DNA nie jest skorelowana z replikacją DNA jądrowego, ale zachodzi pod jego kontrolą (większośc lub wszystkie enzymy biorące udział w replikacji kodowane przez genom jądrowy!)

• Większość genów chloroplastowych tworzy policistronowe jednostki transkrypcyjne (operony - geny ułożone są obok siebie i razem transkrybowane) - cecha typowa dla Procaryota!.

• Modyfikacja pre-mRNA, splicing.

• W miejscu transkrypcji często zamiana cytydyny na urydynę.

• System translacji przypomina bakteryjny - rybosomy 70S, wrażliwośc na te same antybiotyki, w układach in vitro funkjonują hybrydowe rybosomy (np. z jedną podjednostką z chloroplastu, druga od bakterii), translacja regulowana przez białka regulatorowe (zjawisko rzadkie u bakterii).

• Ekspresja genomu bardziej skomplikowana niż u bakterii - wiele klas promotorów, polimeraz RNA, wieloetapowy proces dojrzewania RNA i inicjacji translacji; do eksprecji genów potrzebnych jest wieleset czynników kodowanych przez jądro.

Rola chaperonów w dojrzewaniu białka:

Białka pomocnicze (chaperony):

• tworzą strukturę przestrzenną białek

• łączą podjednostki białkowe w funkcjonalny oligomer

• pomagaja w transporcie białek przez błony organelli

• zapobiegają tworzeniu się nieprawidłowej, niefunkcjonalnej struktury

Wyróżniamy: nukleoplazminy (w jądrze), chaperoniny (cpn 60 i cpn 10), białka szoku cieplnego HSP.

Rubisco - karboksylaza rybulozodifosforanu. Zbudowana z 8 dużych podjednostek (LSU) i 8 małych podjednostek (SSU). Małe podjednostki kodowane są przez jądro i syntetyzowane w cytoplazmie, duże syntetyzowane są w chloroplaście.

Do niesfałdowanej dużej podjednostki przyłącza się cpn 60 (syntetyzowane w cytoplazmie!). Powoduje odpowiednie sfałdowanie polipeptydu i łączenie się w dimery, a potem w tetramery. Prawdopodobnie wpływaja też na fałdowanie małej podjednostki. Cpn 10 powodują odłączanie cpn 60 od polipeptydu. W chloroplaście do oktameru LSU dołączane jest 8 SSU.

Transport białek z cytozolu do chloroplastu:

Prekursory białek posiadają sekwencje tranzytowe kierujące je do chloroplastów. Białka te (np. podjednostka mała rubisco) rozpoznawane są przez znajdujące się w błonach chloroplastu kompleksy złożone z receptora i białka tworzącego kanał translokacyjny (receptor znajduje się w błonie zewnętrznej, po rozpoznaniu i przyłączeniu sekwencji tranzytowej łączy się z białkiem błony wewnętrznej tworząc kanał). W procesie transportu przez błone zużywane jest ATP (przy przyłączeniu sekwencji tranzytowej i przy transklokacji). Chaperoniny ochraniające białko w cytoplazmie zostają w niej (odpadają w czasie przechodzenia białka przez błonę).

Podobnie wygląda transport białek do światła tylakoidów (np. prekursor plastocyjaniny). W tym przypadku białko musi posiadać 2 sekwencje tranzytowe (kierujące do chloroplastu i do tylakoidu). Po dostaniu się białka do stromy przyłączają się do niego białka szoku cieplnego hsp 70 (zużywane jest przy tym ATP) i odpada sekwencja kierująca do choloplastu. "Na wierzchu" pojawia się sekwencja kierująca do światła tylakoidu, łączy się z receptorem itp.

Podjednostki syntazy ATP (jądro), białko preLHCP (jądro), białko pD1 (kodowany przez chloroplast; składnik psII) - wbudowywane w błony tylakoidów, tylko 1 sekwencja sygnałowa (odcinana dopiero po wbudowaniu).

Transport białek jest więc procesem wieloetapowym. Przebiega nieco inaczej w zależności od "miejsca przeznaczenia".

Czynniki zaangażowane w montaż białek w błonę tylakoidu:

• biegunowe i elektrostatyczne oddziaływania poszczególnych białek ze składnikami błony tylakoidu (w zależności od ładunku reszt aminokwasowych białka moga zostać włączone do błony w ściśle okreslony sposób).

• oddziaływania białka-lipidy

• obecnośc molekularnych chaperonów (potrzebne do włączenia białka w błonę i do translokacji, np. HSP70 konieczny do włączenia w błone LHCP).

• do transportu przez błonę chloroplastu i prawdopodobnie przez błone tylakoidu potrzebne jest ATP (ale nie jest potrzebny potencjał błonowy jak w mitochondrium).

• obecnośc SPF (stromal protein factor), np. HSP w przypadku LHCP lub chaperonina 60 do łączenia się podjednostek Rubisco.

Kompleksy w błonach tylakoidów:

• fotosystem I - głównie w tylakoidach niezespolonych

• fotosystem II - głównie w tylakoidach zespolonych (w granach)

• CF0CF1 = syntaza ATP - część katalityczna po stronie stromy, tylakoidy niezespolone

• cytochrom b - równomiernie

Wszystkie białka transportujące elektrony z wyjątkiem plastocyjaniny są białkami transbłonowymi (plastocyjanina "podczepiona" jest pod błoną). Kompleksy przemieszczaja się w zależności od natężenia światła.

Budowa fotosystemu II:

Duży kompleks mieszanego pochodzenia (część podjednostek pochodzi z genomu jądrowego, część z chloroplastowego). Zbudowany z centrum reakcji, kompleksu antenowego (LHC2 = light harvesting complex, kodowany przez jądro) i kompleksu fotolizy wody. Znajdujące się w kompleksie antenowym liczne cząsteczki chlorofilu reagują z fotonami światła, energia wzbudzenia elektronowego przeskakuje z chlorofilu na chlorofil, aż trafi do centrum reakcji.

W centrum reackji znajdują się białka D1 i D2 (kodowane przez plastyd) i 2 cząsteczki chlorofilu. Z jednej z nich elektron przeskakuje na ściśle określona cząsteczkę (ruchomy przenośnik elektronów znajdujący się w błonie - plastochinon), który przenosi go na cytochrom b6/f.

"Ubytek" elektronów równoważony jest przez elektrony pochodzące z fotolizy wody.

Cytochrom b6/f:

Cytochromy b i f kodowane są przez DNA chloroplastu, białko risce przez genom jądrowy. Rolą kompleksu jest odebranie elektronu od plastochinonu i przeniesienie go na plastocyjaninę. Energia transportu elektronu wykorzystywana jest do transportu H+ do światła tylakoidów, a różnica potencjałów do produkcji ATP przez CF1CF0.

Fotosystem I:

Podobnie jak fotosystem II zawiera centrum reakcji kodowane przez genom plastydu i kompleks antenowy syntetyzowany poza chloroplastem. Ulega wzbudzeniu przez światło, przenosi elektron na ferrodoksynę (ruchome białko w błonie), która z kolei dostarcza go na reduktazę NADP+ (powstawanie NADPH).

Syntaza ATP:

Zbudowana z części transbłonowej CF0 i wystającej do stromy główki CF1. Obie części mają mieszane pochodzenie - podjednostki alfa, beta i eta CF1 oraz I, III i IV CF0 kodowane są przez genom chloroplastowy, natomiast gamma, delta, i podjednostka II syntetyzowane są poza plastydem.

Powstawanie chloroplastów:

• Wszystkie typy plastydów rozwijają się z proplastydów (małych, często mylonych z mitochondriami).

• Błona wewnętrzna wpukla się i odcina do stromy pęcherzyki, którepowiększają się tworząc tylakoidy i łączą się w grana (tworzy się układ równoległych błon wewnętrznych).

• W przypadku niedoboru światła powstają etioplasty z regularną, przypominającą kryształ strukturą zwaną ciałem prolamellarnym. Etioplasty mogą przekształcać się w chloroplasty, kiedy znajdą się w miejscu wystarczająco oświetlonym.

• Z proplastydów mogą też powstawać amyloplasty, elaioplasty i chromoplasty (te ostatnie mogą także powstawać z chloroplastów).

• U roślin jednoliściennych (w przeciwieństwie do dwuliściennych) w obrębie jednego liścia można znaleźć różne stadia rozwoju chloroplastów.

Biosynteza chlorofilu:

kwas alfa-aminolewulinowy -> ... -> porfiryna IX -> protochlorofilid. Protochlorofilid jest ostatnim stadium ciemniiowym syntezy chlorofilu, ma bardzo regularną strukturę (buduje ciało prolamellarne). Protochlorofilid przekształca się w chlorofilid pod wpływem reduktazy protochlorofilidu, która do swojego działania potrzebuje NADPH (który produkowany jest pod wpływem światła - dlatego w ciemności reakcja ta nie może zajść). Chlorofilid przekształcany jest w chlorofil.

Reakcje wiązania dwutlenku węgla:

• Cykl Calvina (C3) - ciąg reakcji niezależnych od światła. Dwutlenek węgla wiązany jest przez rybulozodifosforan (enzym - rubisco). Sześciowęglowa cząsteczka rozpada się na 2 dwa 3-fosfogliceryniany (3-węglowe), przeksztacane w aldehyd 3-fosfoglicerynowy - z jego częsci odtwarzany jest rybulozodifosforan, reszta wykorzystywana jest do syntezy wielu związków organicznych. (6 CO2 -> 1 cząsteczka glukozy). W procesie zużywane jest ATP i NADPH. Rośliny C3 przystosowane są do warunków raczej wilgotnych (wtedy ich metabolizm opłaca się bardziej niż C4).

• U niektórych roślin (C4) zamiast fosfoglicerynianu na początku cyklu powstaje 4-węglowy szczawiooctan. Rośliny takie mają nieco odmienną budowę liścia (wiązki przewodzące otoczone są fotosyntetyzującymi komórkami pochwy wokółwiązkowej - komórki te mają bezgranowe chloroplasty, są w nich tylko równoległe tylakoidy). W komórkach mezofilu przebiega szlak C4 (w pochwach - cykl Calvina). Szczawiooctan może rozpadać się na CO2 i pirogronian, wykorzystywany do cyklu Calvina przez komórki wokółwiązkowe. Rośliny C4 dobrze znoszą wysokie temperatury i suszę (nawet po zamnknięciu aparatów szparkowych mają dostęp do CO2 dla fotosyntezy), ale zużywają więcej energii (np. trzcina cukrowa, kukurydza). Szlaki C3 i C4 przebiegają w różnych miejscach.

• CAM (crassulacean acid metabolism) - występuje u wielu sukulentów (np. gruboszowate). Rośliny wiążą CO2 nocą i wbudowują go w jabłczan magazynowany w wakuoli. W ciągu dnia zamykają szparki, dekarboksylują jabłczan i uwalniają dwutlenek węgla do tkanki liścia. Szlaki C3 i C4 odbywają się w różnym czasie.

Podział plastydów:

Plastydy powstają z już istniejących plastydów - nie ma możliwości wytworzenia przez komórkę chloroplastów de novo. Ilość chloroplastów w określonym typie komórek jest stała, regulacja podziałów jest specyficzna dla danej komórki (i skoordynowana). Podział plastydów nie jest sprzężony z podziałem komórki.

Podział nukleoidu odbywa się różnie w zależności od gatunku, nie ma synchronizacji podziałów. Tuż przed podziałem chloroplast przyjmuje hantlowaty kształt, zakłada się pierścień z filamentów aktynowych, następuje podział. U Cyanidium cordarium podział sprzężony z podziałem jądra i mitochondrium. Kolejny podział w płaszczyźnie prostopadłej do poprzedniego.

Organella dziedziczone są wraz z endoplazmą komórki rozrodczej żeńskiej (dziedziczenie odmateczne). Z gamet męskich są one eliminowane.

Wykład X: Mitochondria

Budowa mitochondrium:

Mitochondria to organella otoczone podwójną błoną - w błonie zewnętrznej znajdują się poryny (kanały wodne), w błonie wewnętrznej systemy transportu elektronów (bardzo dużo białek transbłonowych). Pomiedzy nimi znajduje się przestrzeń perimitochondrialna. Błona wewnętrzna jest silnie pofałdowana (tworzy kristy) - dzięki temu ma dużą powierzchnię. Środek wypełnia matrix zawierająca enzymy (np. do utleniania pirogronianów, kwasów tłuszczowych, cyklu Krebsa). Mitochondria roślinne są mniejsze i mniej regularne niż zwierzęce.

DNA mitochondrialne:

Mitochondria posiadają własny DNA (kolista cząsteczka zbudowana z 2 komplementarnych nici). U różnych organizmów różnice w nim są bardzo duże, może być np. bardzo "oszczędny" (u ludzi) lub zawierać bardzo dużo sekwencji niekodujących (drożdże). Może byc też bardzo różnej wielkości - u ssaków 14-18 tys., u rośli 200-250 par zasad...

Geny DNA mitochondrialnego kodują około 5% białek:

• Część aparatu genetycznego:

• rRNA

• tRNA (u niektórych gatunków, np. pszenicy, kodowane w jądrze)

• białka podjednostek rybosomalnych (nie zawsze)

• Białka związane z fosforylacją oksydacyjną:

• podjednostki 1,2,3 cytochromu c

• część cytochromu b

• podjednostki 6 i 8 F0ATPazy

• czasami podjednostka alfa F1ATPazy

• podjednostki dehydrogenazy NADH

Przez jądro kodowane są m.in. większość podjednostek syntazy ATP, polimeraza DNA i RNA, białka rybosomalne, enzymy cyklu Krebsa, antyport ATP / ADP, podjednostki cytochromu c...

Kod genetyczny DNA mitochondrialnego NIE JEST identyczny z kodem uniwersalnym - występują także różnice pomiędzy gatunkami!

Transport białek do mitochondrium:

Podobnie, jak w przypadku chloroplastów, białka transportowane są przez błony za pomocą transportera (kompleks receptorowy + kanał) - przeniesienie białka wymaga energii związanej z transportem protonów przez błonę. Białko musi posiadać odpowiednią ilość sekwencji transportowych - jedna do matrix lub błony wewnętrznej, 2 do przestrzeni międzybłonowej (najpierw dostaje się do matrix, a dopiero stamtąd przechodzi przez błonę wewnętrzną do przestrzeni perimitochondrialnej, np. cytochrom b2). Cytochrom b2 może też (rzadziej) przedostać się częściowo przez kanał (odcinana sekwencja I) i przemieścić się między błonami (przyczepia się do błony wewnętrznej, która odcina sekwencję II).

Białko przed przejściem przez błonę związane jest z białkami opiekuńczymi (chaperonami)- oddysocjowują one w momencie rozpoczęcia translokacji. Po przedostaniu się białka do matrix przyłączane są kolejne chaperony (mające chronić białko, a potem mające je sfałdować i odłączyć sekwencję tranzytową).

Procesy zachodzące komórce:

CYTOPLAZMA	PREZSTRZEŃ PERIMITOCHONDRIALNA	MATRIX MITOCHONDRIUM
Glikoliza (glukoza -> pirogronian)		pirogronian -> acetyloCoA
	przekształcenie kwasu tłuszczowego w acyloCoA	beta-oksydacja (acyloCoA -> acetyloCoA)
		cykl Krebsa (jednym z enzymów jest dehydrogenaza bursztynianowa znajdująca się w wewnętrznej błonie mitochondrium, należąca też do łańcucha oddechowego).

Budowa wewnętrznej błony mitochondrium:

W wewnętrznej błonie mitochondrium znajdują się kolejne ogniwa łańcucha oddechowego:

• dehydrogenaza NADH (NADH -> NAD+)

• ubichinon (CoQ) - ruchomy przenośnik elektronów

• dehydrogenaza bursztynianowa

• kompleks cytochromów b-c1 (kodowane częściowo przez jądro, częściowo przez mitochondrium)

• oksydaza cytochromowa (3 podjednostki kodowane przez genom mitochondrialny) - przekazuje elektrony na cząsteczki tlenu (2e + 2H⁺ + O₂ -> H₂O)

Dehydrogenaza NADH odbiera 2 elektrony od jonu wodorkowego oddzielonego od NADH i przekazuje je kolejnym kompleksom. Podczas transportu elektronów wyzwala się energia zużytkowana do transportu protonów wbrew gradientowi stężeń (z matrix do przestrzeni międzybłonowej). Wytwarza się duży potencjał błonowy (różnica pH między matrix a przestrzenią perimitochondrialną wynosi około 1, a więc między błonami jest 10 razy więcej jonów H+).

Różnicę potencjałów wykorzystuje syntaza ATP (zbudowana z części transbłonowej F0 i skierowanej do matrix F1). Tworzy ona drogę, którą protony wydostają się zgodnie z gradientem stężeń do matrix, a energia tego przepływu zużywana jest do produkcji wysokoenergetycznych wiązań w ATP. Różnica potencjałów wykorzystywana jest także do transportu pirogronianu i fosforanów (symport) oraz ATP i ADP (antyport).

Porównanie mitochondriów i chloroplastów:

	MITOCHONDRIUM	CHLOROPLAST
Ilość kodowanych polipeptydów:	20-30	do kilkuset
Liczba kopii genomu w organellum:	5-50	20-30
KODOWANE POLIPEPTYDY:	zwykle wszystkie RNA (czasami tRNA w jądrze)	wszystkie RNA
	tylko niektóre białka rybosomalne	1/3 białek rybosomalnych
	niektóre podjednostki syntazy ATP, oksydazy cytochromowej, cytochromu b/c1.	duża podjednostka rubisco, podjednostki fotosystemów, cytochromu b6/f, 6 podjednostek syntazy ATP...
Transport białek:	najpierw przez obie błony do matrix, potem ewentualnie przez wewnętrzną błonę do przestrzeni perimitochondrialnej	przez obie błony do stromy, a potem ewentualnie do błony lub światła tylakoidu
Lokalizacja syntazy ATP:	podjednostka F1 w matrix, duże stężenie H+ w przestrzeni międzybłonowej	podjednostka F1 w stromie, duże stężenie H+ w świetle tylakoidów

Pochodzenie mitochondriów i chloroplastów:

Mitochondria i chloroplasty powstały na drodze endosymbiozy - pochodzą od jednokomórkowych, prokariotycznych organizmów, które zostały zasymilowane przez eukarionty. Stanowią dla nich źródło energii, związków organicznych i tlenu.

2,5 miliarda lat temu pojawiły się organizmy fotosyntetyzujące i stężenie tlenu w atmosferze znacznie wzrosło. Wtedy pojawiły się pierwsze bakterie tlenowe. Mitochondria zostały wchłonięte znacznie wcześniej, niż nastąpił podział na rośliny, grzyby i zwierzęta.

Dowody na pochodzenie endosymbiotyczne:

• specyficzne DNA i RNA (rRNA ma częściowo takie same sekwencje, jak bakterie).

• podobne rybosomy 70S (w warunkach in vitro można stworzyć działające hybrydy rybosomów bakteryjnych i chloroplastowych).

• wrażliwość na te same inhibitory: chloramphenicol, streptomycyna, erytromycyna, akrydyna, bromek etydyny

• możliwość hybrydyzacji DNA i RNA z chloroplastów i sinic

• wiele homologii genów

• podobne chaperony (!)

2

---