SPRAWOZDANIE z ćwiczeń pt.: OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW na przykładzie pepsyny
Wykonali :
Temat: Oznaczanie aktywności pepsyny wobec hemoglobiny metodą Ansona
Zasada metody: Metoda ta polega na pomiarze ilości tyrozyny i tryptofanu zawartych w peptydach uwolnionych przez enzym z substratu (np. kazeina, białka soi). Peptydy te, w odrożnieniu od białek, nie ulegają wytrąceniu pod wpływem 3% kwasu trichlorooctowego. Natomiast wytrącone kwasem białka usuwa się z mieszaniny przez wirowanie lub sączenie.
Enzymatyczną hydrolizę białka (substratu) prowadzi się w pH 8,6 i temp. 37°C. Oznaczenie zawartości tyrozyny i tryptofanu w uwolnionych przez enzym peptydach wykonuje się przy użyciu odczynnika Folina. Końcowa barwa, ktorej natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny i tryptofanu w probie, jest wynikiem redukcji odczynnika fosforomolibdenofosforowolframowego (odczynnik Folina) w środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego, zachodzącej pod wpływem wymienionych aminokwasow. Stężenie barwnego produktu w próbie oznacza się mierząc pochłanianie (absorbancję) promieniowania świetlnego o długości fali 720 nm. Miarą aktywności trypsyny będzie ilość μmoli tyrozyny zawarta w uwolnionych peptydach.
Cel ćwiczenia: Oznaczanie aktywności pepsyny wobec hemoglobiny poprzez produkty hydrolizy - tryptofanu i tyrozyny
Wykonanie:
Hydroliza:
Na początku dodaliśmy do 4 szklanych probówek w 3 powtórzeniach 0,2, 0,3, 0,4 i 0,5 ml roztworu pepsyny, po czym po 1 ml 5% roztworu hemoglobiny a następnie dopełniliśmy do 5 ml buforem o pH 2,2.
Następnie wszystkie próby były inkubowane przez 30 min w 37 ºC. Równolegle inkubowaliśmy 3 próby kontrolne zawierające tylko roztwór pepsyny w ilości 0,5 ml i dopełniliśmy do 4 ml buforem o pH 2,2.
Po inkubacji do wszystkich prób dodaliśmy po 5 ml 20% roztworu TCA, a do prób kontrolnych ponadto 1 ml roztworu hemoglobiny.
Próby były przetrzymywane w temp pokojowej przez 5 min mieszając, a następnie przesączyliśmy je przez bibułę do kolbek stożkowych.
-
Oznaczenie produktów hydrolizy (tyrozyny i tryptofanu):
Najpierw dodaliśmy 2 ml wody destylowanej do 0,5 ml klarownego przesączu a następnie 5 ml 0,5 M roztworu NaOH i 0,5 ml rozcieńczonego (1:1,5) odczynnika Folina-Ciocalteu.
Kolejno dokładnie wymieszaliśmy zawartość probówek.
Po 10 min odczytaliśmy absorbancję przy długości fali 720 nm wobec 1 próby odniesienia/ślepej (przygotowanej w analogiczny sposób jak próby badane zawierające lecz zamiast ekstraktu 0,5 ml 10% TCA) a następnie dokonaliśmy pomiaru 3 prób kontrolnych i 12 badanych.