Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Przedmiot: Enzymologia

Temat ćwiczenia:

Wpływ aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznej

na przykładzie hydrolizy skrobi

Wprowadzenie:

Na szybkość przebiegu reakcji enzymatycznych mają zasadniczy wpływ różnego rodzaju aktywatory. Substancje te nie biorą udziału w reakcji, jednak aktywują lub zwiększają aktywność enzymów. Można je podzielić na trzy grupy:

1. kofaktory - koenzymy, grupy prostetyczne oraz jony niektórych metali, wbudowanych w cząsteczkę apoenzymu, a także niektóre aniony nieorganiczne

2. makrocząsteczki białkowe, odkrywające grupy czynne enzymu, przekształcające nieaktywną formę enzymu w aktywną

3. drobnocząsteczkowe połączenia organiczne, usuwające wpływ związków hamujących, redukujące potencjał oksydoredukcyjny środowiska

Organizm człowieka wymaga dostarczenia z pożywieniem niezbędnych mikroelementów, które są aktywatorami wielu enzymów. Zwykle są one częściami układu aktywującego, tzn. białko enzymatyczne jest niezdolne do aktywacji substratu, jeśli brakuje odpowiedniego jonu metalu. Metale są niezbędne do wytworzenia wiązania między enzymem a substratem lub między enzymem, koenzymem i substratem, albo wchodzą w skład centrum katalitycznego enzymu i warunkują jego działanie (bez nich enzym jest nieczynny). Do kationów aktywujących niektóre enzymy (enzymy przenoszące elektrony - fosfatazy, dehydrogenazy, lipaza i inne) należą Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Na⁺, K⁺. Koenzymami są najczęściej witaminy i ich pochodne, odgrywają one rolę zwłaszcza w enzymach nieproteolitycznych. W przypadku enzymów proteolitycznych zasadnicze znaczenie mają jony Ca²⁺ (stabilizują aminopeptydazy, proteinazy serynowe i tiolowe), Co²⁺ (aktywują aminopeptydazy), Mn²⁺ (wpływają na aktywność prolidazy) i Zn²⁺ (warunkuje aktywność karboksypeptydazy A). Metale ciężkie hamują działanie enzymów. Aniony wywierają niewielki wpływ na działanie enzymów, wyjątek stanowi aktywowanie amylazy oraz katepsyny C przez chlorki.

Niektóre enzymy wytwarzane są w postaci nieaktywnej, jako prekursory enzymów (proenzymy lub zymogen), a ich działanie pobudzane jest przez przekształcenie w wyniku aktywności innych enzymów, np. enterokinaza przekształca nieaktywny trypsynogen w aktywną trypsynę. Następuje to najczęściej przez przecięcie łańcucha peptydowego proenzymu w określonym miejscu, co powoduje zmianę konformacji peptydu i odsłonięcie miejsca aktywnego.

Aktywatorami nazywamy także czynniki, które usuwają wpływ inhibitorów, ograniczających czasowo działanie enzymu. Aktywność wielu enzymów jest hamowana w obecności łagodnych środków utleniających, np. tlenu atmosferycznego, co jest katalizowane przez metale ciężkie, znajdujące się w śladowych ilościach w odczynnikach lub materiale badawczy, czy tez pochodzące z metalowych przedmiotów używanych podczas preparowania enzymów. Taka inhibicja jest często odwracalna, gdy np. zredukujemy grupę -S-S- za pomocą cysteiny, odtworzona zostanie aktywna grupa -SH, natomiast związki kompleksujące mogą związać metale ciężkie. Do enzymów, których aktywność zależy od obecności wolnych grup tiolowych należą katepsyny B, L i H.

Amylaza to ogólna nazwa enzymów hydrolizujących skrobię, do których zaliczamy α-amylazę, endoamylazę rozkładającą wiązania α-1,4-glikozydowe amylozy i amylopektyny; β-amylazę, rozkładającą skrobię od końca łańcucha, rozcinając wiązania α-1,4-glikozydowe oraz amyloglukozydazę i glukoamylazę, odcinające glukozę na końcu łańcucha skrobiowego, rozkładające zarówno wiązania α-1,4-glikozydowe, jak i α-1,6-glikozydowe. W wyniku działania α-amylazy powstają α-dekstryny o małej masie cząsteczkowej i niewielka ilość maltozy. W wyniku działania β-amylazy powstają duże amylodekstryny i znaczna ilość maltozy.

Z jodem skrobia daje zabarwienie niebieski, kolejne produkty pośrednie rozkładu skrobi dają odpowiednio barwę: niebieskofioletową (amylodekstryny), czerwoną (erytrodekstryny), czerwonobrunatną (achrodekstryny). Maltoza nie daje zabarwienia z jodem.

Optymalne warunki działania amylaz, to, w zależności od pochodzenia enzymu, pH lekko kwaśne (zbożowe) do obojętnego (zwierzęce), temperatura 50-65^oC (zbożowe) i 37^oC (zwierzęce), obecność jonów Cl^-.

Celem ćwiczenia jest określenie wpływu NaCl i mocznika na szybkość reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi.

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1. Oznaczanie aktywności amylazy

Przygotować 50 ml wody destylowanej, z czego 40 ml zagotować w zlewce odpornej na ogrzewanie. Przygotować 2% roztwór skrobi (stężenie substratu ustalić z prowadzącym) przez rozprowadzenie 1 g skrobi w 5 ml wody, zawiesinę wlać, mieszając, do 40 ml wrzącej wody, przepłukać resztą wody (5 ml) zlewkę, całość zagotować i szybko schłodzić (łączna objętość wody - 50 ml). Przygotować rozcieńczenia enzymu według propozycji prowadzącego (2-krotne, 5-krotne lub 10-krotne).

We wgłębieniach porcelanowej płytki umieścić po kolejno po kilkanaście kropli rozcieńczonego roztworu I w KI (barwa słomkowożółta). Do probówki wlać 3 ml 2% roztworu skrobi (świeżo przygotowanego) oraz 1 ml roztworu enzymu. Dokładnie zamieszać. Co 1 lub 2 min (według polecenia prowadzącego) pobierać roztwór pipetą i nanosić na płytkę porcelanową do kolejnych wgłębień z płynem Lugola, mieszając szklaną bagietką. Jednocześnie mierzyć stężenie cukrów prostych przy pomocy refraktometru. Na podstawie barwy określić powstające produkty. Próbę prowadzić do ustabilizowania stężenia produktów, oznaczanego refraktometrycznie. W razie konieczności powtórzyć doświadczenie dla mniejszego lub większego stężenia enzymu (ustalić z prowadzącym).

Wyniki przedstawić w formie tabeli/tabel, uwzględniając opis produktów w pierwszej części reakcji oraz przedstawienie „liczbowe”(stężenie produktów) całego przebiegu reakcji lub drugiej części. Narysować wykres zależności stężenia produktów reakcji od czasu. Określić rząd reakcji oraz wyznaczyć stałą szybkości reakcji.

Doświadczenie powtórzyć dla innego stężenia substratu, wyznaczyć szybkości początkowe reakcji oraz obliczyć K_M i V _max.

Zadanie 2. Określanie wpływu aktywatorów i inhibitorów oraz pH na aktywność amylazy

Przygotować roztwór skrobi j.w. lub wykorzystać roztwór skrobi z ćwiczenia 1. Do 3 probówek wprowadzić po 3 ml roztworu skrobi, a następnie do jednej probówki dodać 1 ml roztworu enzymu j.w., do drugiej 1 ml r-ru enzymu z dodatkiem 0,06 g NaCl (wcześniej wymieszanego), a do trzeciej 1 ml roztworu enzymu z dodatkiem mocznika (również uprzednio wymieszanego). Reakcję prowadzić jw., mierząc stężenie refraktometrycznie cukrów, po upływie czasu niezbędnego w poprzednim ćwiczeniu do otrzymania achrodekstryn (barwa czerwonobrunatna w reakcji z jodem w KI) lub nieco krótszym dodać do wszystkich prób po 2 krople roztworu I w KI i zamieszać (można pobrać kilka kropli do płytki porcelanowej z płynem Lugola w zagłębieniach). Pierwsza próba stanowi próbę kontrolną. Określić w jakich warunkach preparat enzymatyczny wykazał najwyższą aktywność.

Zagadnienia do przygotowania:

1. Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych.

2. Mechanizmy aktywacji i inhibicji enzymów.

3. Rodzaje substancji aktywujących, ich wpływ na działanie odpowiednich enzymów.

Literatura:

1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii”, PWN Warszawa - Poznań 1982.

2. Stryer L.: „Biochemia”, PWN Warszawa 1986.

3. Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)”, Wydawnictwo UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000.

4. Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników żywności”, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005.

---