Data oddania sprawozdania: 11.04.2013
Termin laboratorium: czwartek 11:15
Sprawozdanie nr 1
Mikrobiologia
Cw 1 - Morfologia komórki i kolonii
Cw 2 - Morfologia komórki bakteryjnej Barwienie złożone
Cw 3 - Morfologia grzybów drożdżowych i pleśni
Opracował: Wojciech Chudyk
Nr indeksu: 191802
Wydział: Inżynieria Środowiska
Kierunek: Ochrona Środowiska
Cw 1 - Morfologia komórki i kolonii
Cel ćwiczenia:
Zbadanie morfologii poszczególnych komórek bakteryjnych. Należało wykonać barwienie pozytywne proste oraz barwienie negatywne. Określenie kształtu budowy bakterii pozwala na zakwalifikowanie jej do jednego z trzech podstawowych typów morfologicznych: skręconego, cylindrycznego lub kulistego.
Zadanie 1 – Morfologia komórki – wykonanie barwienia prostego błękitem metylenowym
Wykonanie:
Na wstępie szkiełko przedmiotowe zostało odtłuszczone na sucho za pomocą kawałka mydła. Następnie wyżarzono ezę nad zapalonym palnikiem. Następnie małym palcem tej ręki, w której trzymana była eza, wyciągnięto korek probówki, w którym znajdował się materiał doświadczalny i opalono koniec probówki. Za pomocą ezy została pobrana hodowla bakterii, po czym powtórnie wlot probówki został opalony. Wykonano rozmaz pobranej zawiesiny na szkiełku przedmiotowym i odstawiono je w celu wysuszenia. Gdy preparat był już suchy opalono go nad palnikiem, 3-krotnie przesuwając nad palnikiem.
Po chwili zalano utrwalony preparat błękitem metylenowym na 1,5 minuty. Po tym czasie szkiełko wraz z preparatem zostało spłukane wodą i osuszone bibułkami. W miejscu, gdzie znajdował się rozmaz z zawiesiny bakterii położono jedną kroplę oleju imersyjnego i preparat umieszczono na stoliku mikroskopowym. Po wybraniu obiektywu imersyjnego (100x), obniżono go za pomocą śruby mikrometrycznej aż do momentu zetknięcia. Nastawiono ostrość i obserwowano preparat.
Obserwacje:
Zaobserwowano zabarwione na niebiesko formy ziarniste występujące w skupiskach.
(Rysunek 1- załącznik)
Zadanie 2 – Morfologia komórki – wykonanie barwienia negatywnego
Wykonanie:
Na przygotowany preparat jak w zad. 1 nałożono jedną kroplę nigrozyny i następnie drugim szkiełkiem, trzymając je pod kątem 45o, przeciągano wzdłuż 1 szkiełka, rozmazując nigrozynę wraz z bakteriami po całej powierzchni 1 szkiełka. Po wyschnięciu również nałożono kroplę oleju imersyjnego i dalsza część zadania przebiegała analogicznie jak w zadaniu 1.
Obserwacje:
Zaobserwowano formy cylindryczne, niezabarwione laseczki na niebieskim tle.
(Rysunek 2- załącznik)
Wnioski:
Zadanie 1:
Zaobserwowane formy były widziane na niebiesko, ponieważ podczas barwienia pozytywnego prostego barwiono sam obiekt obserwacji. Przez mikroskop zaobserwowano formy ziarniste występujące w skupiskach, przypuszczalnie jest to bakteria Sarcina sp.
Zadanie 2:
Zaobserwowane formy były niezabarwione, ponieważ barwienie negatywne powoduje zabarwienie samego tła na niebiesko. Przez mikroskop zaobserwowano formy cylindryczne, niezabarwione laseczki na niebieskim tle. Prawdopodobnie była to bakteria Bacillus sp
Cw 2 - Morfologia komórki bakteryjnej Barwienie złożone
Cel ćwiczenia:
Określenie budowy ściany komórkowej bakterii poprzez wykonanie barwienia Grama i Wirtza.
Zadanie 1. Wykonanie barwienia metodą Grama
Wykonanie:
Na odtłuszczonym szkiełku wykonano rozmaz z zawiesiny bakterii i preparat utrwalono. Następnie utrwalony preparat zanurzono w fiolecie krystalicznym na 1,5 minuty. Po wyciągnięciu szkiełka i opłukaniu wodą destylowaną, zanurzono preparat w płynie Lugola na kolejne 1,5 minuty. Po spłukaniu wodą, szkiełko wraz z materiałem było zanurzone 15 razy w denaturacie. Następnie preparat zanurzono w fuksynie na 30 sekund i już opłukane, oczyszczone szkiełko zostało umieszczone na stoliku mikroskopowym. Położono kroplę oleju imersyjnego i nastawiono obiektyw (100x).
Obserwacje:
Zaobserwowano skupiska ziarnistych fioletowych form. (Sarcina lutea)
(Rysunek 3- załącznik)
Zaobserwowano podłużne formy pałeczki, zabarwione na czerwono.( E.coli) (Rysunek 4- załącznik)
Zadanie 2. Wykonanie barwienia przetrwalników metodą Wirtza.
Wykonanie:
Wykonano preparat utrwalony z zawiesiny laseczek Bacillus sp. jak w zadaniu 1. Utrwalony preparat włożono na 5 minut do wrzącej łaźni parowej, w której znajdowała się zieleń malachitowa. Po ostygnięciu i opłukaniu preparatu, zalano go fuksyną fenolową na 1 minutę. Następnie spłukano, osuszono i obserwowano jak w zad. 1.
Obserwacje:
Zaobserwowano zabarwione na czerwono cylindryczne formy z zielonymi ziarnami.
(Rysunek 5- załącznik)
Wnioski:
Zadanie 1:
Zaobserwowano ziarniste formy koloru fioletowego.
Świadczy to o tym, że bakterie te mają grubą warstwę mureiny w ścianie komórkowej i nie utraciły barwnego kompleksu. Zaobserwowano podłużne formy pałeczki, zabarwione na czerwono. Oznacza to, że utraciły barwny kompleks po zastosowaniu alkoholu i przyjęły kolor drugiego barwnika kontrastowego. Stało się tak, ponieważ posiadają one o wiele cieńszą warstwę mureiny w ścianie komórkowej. Zatem bakterie Sarcina lutea są gramdodatnie, natomiast bakterie E.coli gramujemne.
Zadanie 2:
Zaobserwowano zabarwione na czerwono bakterie Bacillus sp., a w środku umiejscowione centralnie, zielone endospory. Świadczy to o tym, że laseczka Bacillus sp. występuje zarówno w postaci komórek wegetatywnych (świadczy o tym czerwone zabarwienie) jak i w postaci komórek przetrwalnikowych (endospory zabarwione na zielono).
Cw 3 - Morfologia grzybów drożdżowych i pleśni
Cel ćwiczenia:
Określenie morfologii komórki drożdży Saccharomyces cerevisiae na preparacie przyżyciowym oraz za pomocą barwienia fioletem krystalicznym, dostrzeżenie ich worków oraz komórek pączkujących. Wykonano także preparat przyżyciowy w celu określenia morfologii wybranej pleśni.
Zadanie 1 – Obserwacja komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae na preparacie przyżyciowym
Wykonanie:
Z hodowli drożdży Saccharomyces cerevisiae pobrano ezą niewielką ilość materiału i umieszczono ją na szkiełku podstawowym. Następnie rozcieńczono pobraną próbkę kroplą soli fizjologicznej. Preparat przykryto szkiełkiem nakrywkowym i położono kroplę olejku imersyjnego, komórki drożdży były obserwowane pod obiektywem 100x.
Obserwacje:
Zaobserwowano bardzo dużą ilość okrągłych, jasnych komórek drożdży oraz zarodnie workowe.
(Rysunek 6- załącznik)
Zadanie 2 – Barwienie komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae za pomocą fioletu krystalicznego
Wykonanie:
Po pobraniu hodowli komórek drożdży ezą i wykonaniu rozmazu na szkiełku przedmiotowym, preparat utrwalono i zalano fioletem krystalicznym na 1,5 minuty. Na spłukane i osuszone szkiełko nałożono kroplę oleju imersyjnego i obserwowano materiał przy powiększeniu 100x.
Obserwacje:
Zaobserwowano skupiska zabarwionych na fioletowo komórek drożdży (niektóre drożdże pączkowały).
(Rysunek 7- załącznik)
Zadanie 3 – Barwienie komórek Candida lipolytica za pomocą błękitu metylenowego
Wykonanie:
Po utrwaleniu preparatu z komórkami Candida lipolytica, zalano go paroma kroplami błękitu metylenowego i pozostawiono na około 1 minutę. Po tym czasie szkiełko spłukano wodą, osuszono bibułką i obserwowano pod powiększeniem 100x, umieszczając uprzednio kroplę olejku imersyjnego na środku szkiełka.
Obserwacje:
Zaobserwowano zabarwione na niebiesko komórki grzyba.
(Rysunek 8- załącznik)
Zadanie 4 – Obserwacja grzybów na preparacie przyżyciowym
Wykonanie:
Wybrano szalkę Petriego, na której znajdowała się kolonia grzyba pleśniowego (PARAPET). Na szkiełku umieszczono pobrany ezą materiał. Umieszczono na nim kroplę soli fizjologicznej. Preparat przykryto szkiełkiem nakrywkowym i położono kroplę olejku imersyjnego, komórki pleśni były obserwowane obiektywem pod 100x.
Obserwacje:
Zaobserwowano sporangia pleśniaka.
(Rysunek 9- załącznik)
Wnioski
Zadanie 1: Zaobserwowano bardzo dużo komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae. Były one okrągłe i bezbarwne. W środku można było dostrzec zarodnie workowe (max. 3 w jednej komórce) ponieważ drożdże właściwe wytwarzają worki oraz zarodniki. Drożdże te należą do workowców i są drożdżami właściwymi.
Zadanie 2: Po zabarwieniu drożdży Saccharomyces cerevisiae okazało się, że są one gramdodatnie, ponieważ barwią się na fioletowo. Większość grzybów jest gramdodatnia. Ponadto w tej próbie można było zauważyć pączkowanie drożdży, czyli jeden ze sposobów rozmnażania tego rodzaju grzyba.
Zadanie 3: Pod mikroskopem obserwowano niebieskie komórki Candida lipolytica. Mają inną morfologię niż wcześniej obserwowane drożdże, ich kształt nie był regularny ani okrągły, ale owalny i różnej wielkości. Natomiast ich nagromadzenie było równie duże.
Zadanie 4: W preparacie zaobserwowano pędzlaka. Z jego grzybni wyrastały pionowo strzępki grzybni, które się rozwidlają. Zarodniki są na szczycie tworząc łańcuszki. Te zarodniki to konidia, służą do rozmnażania bezpłciowego.