Laboratorium biochemii

Hydroliza enzymatyczna białka (ćw H)

1. Cel ćwiczenia

• Obserwacja i porównanie postępu reakcji hydrolizy białka katalizowanej przez naturalny zestaw trzustkowych enzymów proteolitycznych w obecności i nieobecności białkowego inhibitora,

• Zapoznanie się z metodą oznaczania stężenia białek i peptydów- metodą Lowry’ego.

1. Odczynniki

• 0,15% roztwór pankreatyny (mieszanina enzymów proteolitycznych),

• 0,5% kazeina w 0,1M buforze fosforanowym o pH 7,8 – substrat,

• 0,08% roztwór wodny inhibitora sojowego,

• 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,8,

• 5% kwas trój chlorooctowy (TCA),

• Odczynnik miedziowy A (2% Na₂CO₃, 0,1M NaOH),

• Odczynnik miedziowy B (0,5% CuSO₄ ∙ 5H₂O w 1% C₆H₅O₇Na₃ ∙ 2H₂O),

• Odczynnik Folina-Ciocalteu (produkt firmy SIGMA) .

1. Szkło i aparatura

• Probówki chemiczne na 20 i 5 ml,

• Probówki wirówkowe (plastikowe),

• Pipety automatyczne i tipsy,

• Cylindry miarowe,

• Parafilm,

• Kuwety,

• Specol,

• Termostat nastawiony na 37ºC,

• Wirówka laboratoryjna UNIVERSAL 320.

1. Wykonanie ćwiczenia

• Przygotowano 18 suchych i czystych probówek chemicznych. Podpisano je numerami od 1 do 14, a pozostałe 4 symbolami „E”, „E+I”, „P+W”, „P+I”.

• Przygotowano 14 probówek wirówkowych. Podpisano je numerami od 1 do 14.

• Do probówek wirówkowych dodano po 3ml 5% TCA.

• Do probówek chemicznych „E” i „E+I” dodano po 7ml 0.5% kazeiny oraz po 7ml 0.1M buforu fosforanowego o pH 7.8

• Do probówki chemicznej „P+W” dodano 2ml 0.15% roztworu pankreatyny i 2ml wody destylowanej.

• Do probówki chemicznej „P+I” dodano 2ml 0.15% roztworu pankreatyny i 2ml 0.08% roztworu inhibitora sojowego.

• Mieszaniny w probówkach chemicznych „E”, „E+I”, „P+W”, „P+I” dokładnie wymieszano i inkubowano w łaźni wodnej w 37 przez 5 min.

• Po zakończeniu inkubacji zawartość probówki „P+W” przelano do probówki „E”, a zawartość probówki „P+I” przelano do probówki „E+I”

• Probówki „E” i „E+I” zamknięto parafilmem i dokładnie wymieszano. Od tego momentu zaczęto mierzyć czas.

• Po dokładnym wymieszaniu mieszanin z probówki „E” pobrano 2ml mieszaniny i dodano do probówki wirówkowej nr 1, natomiast 2ml mieszaniny pobranej z probówki chemicznej „E+I” przeniesiono do probówki wirówkowej nr8.

• Zawartość probówek wirówkowych dokładnie wymieszano.

• Jednocześnie kontynuowano inkubację probówek chemicznych „E” i „E+I” w 37

• Z probówek „E” oraz „E+I”, pobierano dokładnie po 2ml mieszaniny z probówki „E” do kolejnych probówek wirówkowych nr: 2, 3, 4, 5, 6, 7 oraz dokładnie po 2ml mieszaniny z probówki „E+I” do kolejnych probówek wirówkowych nr: 9, 10, 11, 12, 13, 14. Roztwory pobierano odpowiednio po 2, 4, 6, 12, 18, 24 minutach od rozpoczęcia inkubacji.

• Przygotowano odpowiednią liczbę probówek wirówkowych, które podczas wirowania były przeciwwagami. Probówki zrównoważono wobec siebie na wadze analitycznej.

• Mieszaniny zawarte w probówkach wirówkowych wirowano przez 10 min przy 3500 obr./min.

• W tym czasie przygotowano odczynnik miedziowy poprzez zmieszanie 100ml odczynnika miedziowego A z 2ml odczynnika B.

• Do 14 ponumerowanych probówek chemicznych odmierzono po 1 ml klarownego supernatantu odpowiednio z każdej odwirowanej mieszaniny.

• Do każdego przesączu w probówkach dodano po 5ml odczynnika miedziowego. Po dodaniu odczynnika miedziowego do probówki chemicznej nr 1 i wymieszaniu, zaczęto odmierzać czas 7 min dla tej próbki. Tak samo postępowano z następnymi próbkami.

• Odczynnik miedziowy dodawano do próbek w odstępie 30’’

• Po upływie 7 min od momentu rozpoczęcia reakcji dla przesączu nr 1 z odczynnikiem miedziowym, dodawano po 0,5ml odczynnika Folina-Ciocalteu, mieszając dokładnie próby.

• W momencie dodania odczynnika Folina-Ciocalteu do próby nr 1 zaczęto odmierzać czas 20 min dla tej próbki. Tak samo postępowano z następnymi próbkami.

• W tym czasie kilkukrotnie mieszano wszystkie próby.

• Po upływie 20 min inkubacji dla każdej próby odczytano absorbancję przy długości fali 750nm dla prób 2-7, dla których odnośnikiem była próba 1 oraz dla prób 9-14 z próbą nr 8 jako odnośnikiem.

1. Tabele pomiarowe

Nr próbki	czas reakcji [min]	A750
E	E+I
1	8	0
2	9	2
3	10	4
4	11	6
5	12	12
6	13	18
7	14	24

1. Analiza wyników i wnioski

Legenda:

E E+I

• Wraz ze wzrostem czasu inkubacji, wzrasta stężenie białka, którego miarą jest absorbancja. W doświadczeniu użyta długość fali do mierzenia absorbancji to 750nm,

• Próbki oznaczone jako E+I mają mniejsze wartości w stosunku do próbek E, co wskazuje na użycie w nich inhibitora,

• Doświadczenie pokazuje, że jak zakładaliśmy, inhibitor zmniejsza szybkość reakcji enzymatycznej,

• Inhibitor sojowy działa jako inhibitor kompetencyjny i nie hamuje całkowicie reakcji enzymatycznej, ponieważ hamuje jedynie trypsynę i chymotrypsynę. W doświadczeniu użyliśmy mieszaniny enzymów proteolitycznych- pankreatynę, która dodatkowo zawiera również elastazę i karbosypeptydazę, na których aktywność inhibitor sojowy nie ma wpływu.

• Cel ćwiczenia został osiągnięty