Agnieszka Troszczyńska

Dominika Szewczak

Magdalena Rysiejko

Roksana Sołtysik

Techniki analizy tkanek – protokół I

Przygotowanie preparatu histologicznego jest złożonym procesem składającym się z kilku etapów. Celem jest uzyskanie trwałego, zabarwionego skrawka materiału (tkanki lub narządu), który można oglądać w mikroskopie świetlnym

Aby utworzyć preparaty parafinowe w pierwszej kolejnośći należy wybrać jaki rodzaj materiału jest nam potrzebny.

Pobieranie materiału:

Nasz materiał, w tym przypadku dżdżownicę Dendrogeana Veneta myjemy z zanieczyszczeń i umieszczamy w 10% alkoholu w celu „uśpienia”. Następnie przy pomocy nożyczek i pęsety tniemy na małe kawałki aby uzyskać materiał do dalszej obróbki.

Utrwalanie: 

Do utrwalania materialu stosuje się 4 % PFA- 40 do 60 minut.

Utrwala się w celu ustabilizowana białek oraz zatrzymania wszelkich procesów metabolicznych, zachowanie materiału w jego pierwotnej formie, wstępnego utwardzenia i po to by móc zabarwić materiał.

Odwadnianie:

ddH20- 3x 5 min

Przy pomocy alkoholu: 

30% - 30 min

50% - 60 min

70% - 24h

80% - 24h

90% - 24h

96% - 24h

alkohol absolutny I (100%)- 8h

alkohol absolutny II - 16h

alkohol absolutny + benzen (1:1) - 15 min

benzen I - 10 min

benzen II - 10 min

Materiał odwadnia się po to by móc zalać go parafiną.

Przepajanie tkanki odbywa się w cieplarce, gdzie materiał zanurzony jest w parafinie z benzenem i umieszczony w zamkniętym naczyńku. Możliwe jedynie po odwodnieniu, ponieważ parafina nie miesza się z wodą.

benzen + parafina (1:1) 30 min

parfina I - 2h

parafina II - 24h

Przepajanie tkanki jest o tyle istotne, dlatego że materiał „nasiąka” parfiną tworząc z nią całość i nie wypada z niej przy krojeniu mikrotomem. Gdyby pominąć ten etap, zanurzony materiał podczas krojenia oddzielił by się od parafiny.

Zatapianie:

Aby móc pokroić materiał należy zatopić tkankę w twardszym, lecz łatwo skrawalnym i biochemicznie obojętnym materiale, z których najpowszechniej stosowana jest parafina. Tkanki ludzkie są miękkie, co uniemożliwia krojenia na cieniutkie skrawki, zatopienie w parafinie „utwardza” nieco materiał i umożliwia krojenie go.

Przepojony skrawek jest następnie zatapiany we wnętrzu bloczka parafinowego, który sporządza się, wlewając parafinę do papierowej „łódeczki” umieszczonej na wodzie lub specjalnej metalowej formy i wprowadzając do wnętrza fragment tkanki, który należy odpowiednio ustawić.

Istnieją maszyny przeprowadzające ten proces w sposób częściowo zautomatyzowany z wykorzystaniem urządzenia do zatapiania/chłodzenia, utrzymującego stałą temperaturę ciekłej parafiny.

Krojenie:

Parafinowy bloczek z zatopioną tkanką należy przykleić i uformować na drewnianej kostce na kształt trapezu odcinając nadmiar parafiny i kształtując za pomocą rozgrzanego narzędzia np. noża.

Kostkę z parafinowym trapezem umieszczamy m mikrotomie - jest to urządzenie do tnące na skrawki (4-60µm). Uzyskujemy w ten sposób cienkie listki parafiny zawierające skrawek tkanki.

Naklejanie:

Szkiełka podstawowe pokrywamy żelatyną (nabiałkowanie poprzez roztarcie żelatyny) i zalewamy wodą na której umieszczamy skrawki. Szkiełko podgrzewamy tak by woda wyparowała. Skrawki pod wpływem temperatury rozprostują się.

Trwałe przyklejenie skrawków uzyskuje się ogrzewając szkiełka w cieplarce w temp 50 °C w ciągu minimum kilku godzin.