Salmonella spp. + wstęp do Enterobacteriaceae

• Enterobacteriaceae (enterobakterie- pałeczki jelitowe)

• Rząd: Enterobacteriales,

• Rodzina: Enterobacteriaceae

• To gram-ujemne bakterie jelitowe o kształcie pałeczek, niesporulujące, fermentujące glukozę i tworzące kwas

• Komórki bakteryjne są dość duże, urzęsione (nieliczne wyjątki). Niektóre szczepy są otoczkowe.To względne beztlenowce. Hoduje się je na prostych podłożach, w warunkach normalnej atmosfery

• Rodzina Enterobacteriaceae- kilkadziesiąt rodzajów bakterii!

• Salmonella

• Proteus

• Escherichia

• Hafnia

• Enterobacter

• Edwardsiella

• Erwinia

• Citrobacter

• Yersinia

• Aquamonas

• Klebsiella

• Rodzina Enterobacteriaceae

• Plesiomonas

• Providencia

• Leclercia

• Morganella

• Shigella

• Serratia

• Cronobacter

• Enterobacter (Cronobacter) sakazakii

• PIF

• Charakterystyka pałeczek z rodzaju Salmonella

• Są to ruchliwe, gram-ujemne pałeczki o wymiarach ok. 0,6-3μm, należące do rodziny Enterobacteriaceae. Dobrze rosną w warunkach tlenowych i beztlenowych. Nie tworzą przetrwalników. Ich temperatury rozwojowe mieszczą się w granicach 5- 45°C. Są wrażliwe na wysoką temperaturę, ale wykazują dużą wytrzymałość na wysuszanie. Wykazują wrażliwość na wysokie stężenia NaCl (tolerancja do 9%) oraz niskie pH.

• Charakterystyka pałeczek z rodzaju Salmonella

• Fermentują glukozę, natomiast nie fermentują laktozy i sacharozy, co jest ważną cecha podczas ich identyfikacji. Są zdolne do dekarboksylacji lizyny, ornityny i argininy. Redukują azotany, wytwarzają siarkowodór. Nie upłynniają żelatyny i nie rozkładają mocznika (cecha różnicująca z Proteus spp.- test na wytwarzanie ureazy).

• Systematyka pałeczek Salmonella spp.

• Rodzaj Salmonella obejmuje dwa gatunki: S. enterica i S. bongori. Gat.Salmonella enterica podzielony został na 6 podgatunków, a każdy z nich, ze względu na różnice w budowie antygenów, na typy serologiczne- tzw. serowary

• Systematyka pałeczek Salmonella spp.

• S. bongori (19 serowarów)

Zaliczamy tu niezwykle rzadko występujące serowary, o znikomej lub niezbadanej patogenności dla człowieka. Serowary te izolowane są najczęściej od zwierząt zmiennocieplnych, takich jak węże czy niektóre gatunki żółwi i jaszczurek.

• Systematyka pałeczek Salmonella spp.

• S. enterica- w obrębie gatunku wyróżniamy 6 podgatunków (subspecies) :

• enterica (ponad 2500 serowarów)

• salamae

• arizonae

• diarizonae

• houtenae

• indica

• Salmonella enterica spp. enterica:

Do głównych serowarów należą:

• S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Virchow, S. Hadar – odpowiedzialne za zapalenie jelita cienkiego i grubego

• S. Typhi - wywołujący dur brzuszny

• S. Paratyphi – wywołujący dury rzekome

• Istnieją także gatunkowo specyficzne serowary Salmonella spp.

• S. Dublin- cielęta

• S. Gallinarum, S. Pullorum- drób

• S. Typhi- człowiek

• Występowanie

• Pałeczki Salmonella spp. najczęściej zasiedlają przewód pokarmowy zwierząt domowych oraz dzikich, drobiu hodowlanego, ptaków, owadów, a także gryzoni. Dużą rolę w przenoszeniu pałeczek Salmonella spp. odgrywają produkty roślinne, szczególnie z terenów nawożonych fekaliami (krążenie pałeczek jelitowych w przyrodzie).

• Występowanie

• Źródłem zanieczyszczenia żywności mogą być także ludzie chorzy i nosiciele tych bakterii. Z racji dużej oporności na wysuszanie, pałeczki te mogą przeżywać przez długi czas w kurzu, paszach, suszonej żywności.

• Występowanie

• Zarazki te bardzo dobrze radzą sobie także w produktach płynnych i mrożonych, w których przeżywają przez długi czas w stanie anabiozy. Najczęściej izolowane są z jaj oraz produktów je zawierających (lody, ciastka, kremy, czekolada).

• Raport EFSA 2011

• 109,844 przypadków salmonellozy u ludzi

w 2009 roku (UE)

• Raport EFSA 2011

• 1,722 food-borne outbreaks of human salmonellosis in 2009r.

• Większość epidemii pokarmowych na tle Salmonella było odnotowanych w Austrii, Francji, Niemczech, Włoszech, Słowacji Hiszpanii i Polsce

• S.Enteridtidis była dominującym serowarem

• Bakteryjne Zatrucia pokarmowe w Polsce od 1 stycznia do 31 grudnia 2010 r.
  oraz w porównywalnym okresie 2009 r.

Zakład Epidemiologii NIZP-PZH http://www.pzh.gov.pl

2010 2009

1. Salmonelloza 9,537 8,847

2. E.coli biegunkotwórcza 1,091 1,259

3. Kampylobakterioza 371 370

4. Gronkowce 217 146

5. Botulizm 30 31

6. Czerwonka bakteryjna 24 30

(szigeloza)

• Salmonella in food
  (najwyższy indeks niezgodności)

1. mięso drobiowe i wyroby mięsne z niego pochodzące przeznaczone do spożycia po obróbce termicznej

2. mięso mielone i wyroby mięsne przeznaczone do spożycia na surowo

3. owoce morza

4. surówki warzywne i sałatki owocowe (RTE food)

5. lody

6. produkty jajeczne

7. odżywki w proszku dla noworodków

• Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa

• Do uruchomienia całej kaskady procesu chorobotwórczego niezbędna jest inwazja drobnoustroju. Substancje o charakterze toksyn, wyzwalające objawy chorobowe, wydzielane są dopiero w organizmie gospodarza, a nie w żywności, jak w przypadku gronkowcowych zatruć pokarmowych.

• Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa

Czynnikami wirulencji zarazka są:

• organella i struktury komórkowe o właściwościach adhezyn i białek inwazyjnych (np. OMP), umożliwiające mu bezpośredni kontakt z komórkami makroorganizmu (adherencję) lub wnikanie do ich wnętrza.

• Substancje o charakterze toksyn wyzwalające objawy chorobowe.

• Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa

• Do substancji o charakterze toksyn zaliczamy:

• LPS ściany komórkowej (charakter endotoksyny, działanie pyrogenne)

• Ciepłooporne i ciepłowrażliwe enterotoksyny identyczne z enterotoksynami ST i LT E.coli, wpływające na zmianę aktywności sekrecyjnej i enterosorpcyjnej nabłonka jelitowego

• Cytotoksyny wywołujące nasilone zmiany zapalne i destrukcję komórek nabłonka jelitowego np. Shiga T

• Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa

Dwie podstawowe formy kliniczne salmonellozy:

zatrucie pokarmowe- gastroenteritis; jest to postać lokalna choroby

gorączki durowe, przebiegające pod postacią infekcji uogólnionych

• Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa

• Dawka infekcyjna dla człowieka to ok. 10⁵ kom/g zanieczyszczonej żywności. Dla osób starszych i niemowląt już 10² kom/g (100 komórek/1 gram) może się okazać wystarczające do wywołania choroby.

• Po przedostaniu się do przewodu pokarmowego pałeczki Salmonella spp. zdolne są do namnażania w jelicie cienkim, kolonizacji i przenikania w głąb ściany jelita. Po uwolnieniu endotoksyn zawartych w komórkach widoczne są objawy salmonellozy: gorączka, bóle brzucha, biegunka, wymioty. Objawy widoczne są po 12-48h od wprowadzenia zarazka do organizmu.

• Salmonelloza- toksykoinfekcja pokarmowa

• Krótko po wystąpieniu objawów zarazki pojawiają się w kale, natomiast bardzo rzadko dochodzi do ich wysiewu do krwi.

• Najczęściej do uogólnienia procesu chorobowego dochodzi w przypadku zakażeń S. Choleraesuis, wtedy następuje gwałtowna zwyżka temperatury (nawet do 40 st. C), a zarazki można wyodrębnić w posiewach z krwi.

• Z krwiobiegiem Salmonella przenoszona jest do różnych narządów, np. płuc, stawów, serca, powodując lokalne zapalenia (pneumonia, osteomielitis, endocarditis, meningitis)

• W przypadku implantacji w pęcherzyku żółciowym, rekonwalescent staje się długotrwałym nosicielem i siewcą zarazka.

• Dur brzuszny
  typhus abdominalis

• PN-EN ISO 6579: 2003
  PN-EN ISO 6579: 2003/ A1 2007

Mikrobiologia żywności i pasz

Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp.

• Etapy identyfikacji pałeczek Salmonella sp.

Oznaczanie obecności pałeczek Salmonella sp. w próbkach żywności obejmuje kilka etapów:

I. Przednamnażanie na wodzie peptonowej

II. Namnażanie selektywne na pożywce półpłynnej

III. Różnicowanie na podłożach agarowych

IV. Identyfikacja w oparciu o testy biochemiczne i serologiczne

• Schemat postępowania

Badana próbka

Zbuforowana woda peptonowa

37 ºC / 18h

Zmodyfikowana pożywka półpłynna Rappaport-Vassiliadis

41.5 ºC / 24h

Agar selektywny

XLD + BGA lub pożywka bizmutawo-siarczynowa

37 ºC / 24h

Badania potwierdzające

• Salmonella sp. - stosowane podłoża

• Zbuforowana woda peptonowa - pożywka stosowana w celu nieselektywnego namnażania pałeczek Salmonella sp., sprzyja regeneracji komórek uszkodzonych podczas procesów technologicznych.

• Zmodyfikowana pożywka półpłynna Rappaport-Vassiliadis (MSRV) – silnie selektywna, zawiera w swoim składzie zieleń malachitową i chlorek sodu, które hamują wzrost mikroflory towarzyszącej.

• Pożywka XLD – zawiera laktozę, L-lizynę, ksylozę, dezoksycholan sodu. Typowe kolonie Salmonella sp. są lekko przezroczyste z czerwonym brzegiem i czarnym centrum.

• Pożywka BGA - z zielenią brylantową, czerwienią fenolową, laktozą, sacharozą. Typowe kolonie Salmonella sp. są koloru podłoża (różowe) i otoczone jasno-czerwoną strefą.

• Salmonella- wzrost na pożywce XLD

• Na pożywce XLD typowe kolonie Salmonella mają czarne środki i są otoczone lekko przezroczystą strefą koloru jasnoczerwonego; wokół kolonii zwłaszcza przy gęstym wzroście Salmonella widoczna jest strefa różowoczerwona, różnej szerokości.

• Salmonella- wzrost na pożywce XLD

• Czarne zabarwienie centralnej części kolonii wynika ze zdolności do produkcji siarkowodoru (H2S)

• Barwa różowa pożywki wokół kolonii dowodzi zdolności dekarboksylacji lizyny obecnej w pożywce XLD

• Salmonella - XLD

• Salmonella- podłoże XLD

Szczepy Salmonella nie wytwarzające siarkowodoru np. (S.Paratyphi A) rosną na pożywce XLD w postaci różowych kolonii z ciemniejszymi, różowymi środkami

• Salmonella - XLD

• Escherichia coli - XLD

• Salmonella- wzrost na podłożu BGA

• Charakterystyczne kolonie są koloru podłoża (różowe) i otoczone jasno-czerwoną strefą.

• Ponieważ bakterie z rodzaju Salmonella nie fermentują laktozy (poza nielicznymi szczepami) ani sacharozy, dochodzi do alkalizacji podłoża i różowego wybarwienia pożywki.

• Salmonella - BGA

• Salmonella na BGA Agar.

• Escherichia coli on BGA Agar. E. coli rozkłada laktozę zawartą w pożywce. Dochodzi do zakwaszenia podłoża i zmiany barwy pożywki na cytrynowo- żółtą.

• Właściwości biochemiczne –
  podłoże TSI (Kliglera)
  - Triple Sugar Iron agar

Agar trójcukrowy (glukoza, laktoza, sacharoza)TSI

- podłoże ma postać słupka i półskosu,

- posiewy wykonuje się w dwojaki sposób: na powierzchni skosu i wgłębnie.

- dokonujemy obserwacji fermentacji glukozy (barwa słupka), laktozy (barwa skosu), wytwarzania gazu (pęcherzyki gazu, porozrywany agar) oraz wytwarzanie H₂S (barwa czarna).

• Podłoże SS Salmonella- Shigella

• Zawiera laktozę, cytrynian sodu, cytrynian żelazowy, oraz czerwień obojętną i zieleń brylantową

• To podłoże wybiórcze stosowane do izolacji pałeczek Salmonella i Shigella

• Zahamowany jest wzrost flory G+

oraz częściowo E. coli

• Podłoże SS Salmonella- Shigella

• Drobnoustroje laktozododatnie (E. coli) rosną w postaci czerwonych kolonii lub bezbarwnych, z czerwonymi środkami

• Salmonella i Shigella tworzą kolonie bezbarwne, przejrzyste, a szczepy wytwarzające siarkowodór tworzą kolonie z czarnymi środkami

• Proteus wzrost obfity, w formie gładkiej, tworzy kolonie duże, płaskie koloru żółtego. Szczepy wytwarzające siarkowodór tworzą również kolonie z czarnym środkiem.

• Pozostałe próby biochemiczne:

1. Wytwarzanie ureazy na pożywce Christensena

2. Dekarboksylacja lizyny

3. Wykrywanie ß-galaktozydazy

4. Reakcja Vogues-Proskauera (VP)

5. Wytwarzanie indolu na pożywce z tryptofanem

• Badanie serologiczne kolonii podejrzanych o przynależność do Salmonella spp.

• Podstawą klasyfikacji pałeczek Salmonella są różnice we właściwościach antygenowych.

• Metoda badania: aglutynacja szkiełkowa

• Określamy obecność antygenów somatycznych (O), rzęskowych (H) oraz otoczkowych (Vi)

• Badanie serologiczne- c.d.

• Wykluczamy szczepy zdolne do autoaglutynacji (roztarcie niewielkiej ilości hodowli z agaru odżywczego z kroplą soli fizjologicznej).

• Czas oczekiwania 30-60s., obserwacja szkiełka na czarnym tle, lupa powiększająca

• Badanie serologiczne- c.d.

• Pierw badanie na obecność antygenu rzęskowego (H)

• Następnie ocena reakcji z surowicami anty-O. Używamy kolejno surowicy poli- i monowalentnej.

• Badanie serologiczne- c.d.

• Korzystamy z surowic anty- OD, OB, OC i OE (bo niemal 100% szczepów izolowanych z żywności należy do tych serogrup)

• Wykrywanie obecności antygenów otoczkowych Vi

Potwierdzenie ostateczne

• Szczepy, określone jako Salmonella lub podejrzane o przynależność do rodzaju Salmonella, w razie niejasności, należy przesłać do ośrodka referencyjnego dla tego drobnoustroju, w celu wykonania ostatecznego typowania.

• Do przesłanego drobnoustroju należy dołączyć wszelkie informacje na jego temat.