Wrocław, 30.03.2012r

Laboratorium inżynierii bioreaktorów

Kinetyka enzymatyczna – zajęcia komputerowe

1. Cel ćwiczenia

Wyznaczanie kinetyki reakcji enzymatycznych za pomocą metod obróbki danych doświadczalnych. Metodami tymi są: „metoda biochemiczna”, korzystająca z regresji liniowej, używany przy tym program to Microsoft Excel^® oraz „metoda wykorzystywana w przemyśle”, korzystająca z regresji nieliniowej, używany przy tym program to OriginPro^®. Dalszym celem ćwiczenia jest porównanie obydwu metod.

1. Kinetyka Michaelisa-Menten

1. Wstęp teoretyczny

Enzymy są katalizatorami wielu reakcji chemicznych. Obniżają one energię aktywacji w wyniku czego szybkość przejścia substratu do produktu jest o wiele szybsza, niż w przypadku kiedy katalizatora brak. Model reakcji enzymatycznej zaproponowali w 1913r. L. Michaelis i M. Menten. W pierwszym etapie reakcji enzym przyłącza substrat tworząc kompleks. Reakcja ta ma stałą szybkość k₁ i jest łatwo odwracalna (k_-1). Następnym krokiem jest powstanie produktu z szybkością k₂. Schemat reakcji pokazano poniżej:

E + SESE + P

Aby kataliza zaszła substrat musi związać się z miejscem aktywnym enzymu. Stężenie enzymu podczas trwania reakcji pozostaje stałe. Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężenie substratu. Początkowo zależność stężenia od szybkości wzrasta liniowo, aż do momentu kiedy wszystkie cząsteczki enzymu tworzą kompleks z substratem. Osiągnięta wtedy szybkość jest szybkością maksymalną i dalsze zwiększanie stężenia substratu nie wpłynie na szybkość reakcji. Założenia te uwzględniono w równaniu kinetyki reakcji Michaelisa-Menten, które przyjmuje postać:

Gdzie: V-szybkość reakcji ,Km-stała Michaelisa-Menten , [S]-stężenie substratu

Wartości Km, czyli stężenie substratu, w którym szybkość reakcji osiąga połowę swojej wartości maksymalnej, oraz wartość maksymalną wyznaczyć można z wykresu zależności stężenia substratu od szybkości reakcji. [1,2]

Rysunek 1 .

Wykres zależności stężenia substratu od szybkości reakcji w idealnej kinematyce Michaelisa-Menten [3]

Dla dokładniejszego, jednoznacznego wyznaczania stałych parametrów równania stosuje się zlinearyzowaną postać – równanie Lineweavera-Burka.

Rysunek 2.

Wykres Lineweavera-Burka [3]

1. Analiza danych doświadczalnych

Cs	r	1/Cs	1/r
0,10	0,021	10,00	46,67
0,20	0,038	5,00	26,67
0,30	0,050	3,33	20,00
0,50	0,068	2,00	14,67
0,75	0,083	1,33	12,00
1,00	0,094	1,00	10,67
1,50	0,107	0,67	9,33
2,00	0,115	0,50	8,67
2,50	0,121	0,40	8,27
3,00	0,125	0,33	8,00
4,00	0,130	0,25	7,67
5,00	0,134	0,20	7,47
7,50	0,139	0,13	7,20
10,00	0,142	0,10	7,07
15,00	0,144	0,07	6,93
20,00	0,146	0,05	6,87

Tabela 1.

Dane doświadczalne (zadane przez prowadzącą)

Legenda:

C_s – stężenie substratu

r- szybkość reakcji

Wykres 1.

Idealna kinetyka Michaelisa-Menten

Wykres 2.

Idealna kinetyka Michaelisa-Menten

Wykres odwrotności

• Wyznaczanie parametrów równania Michaelisa-Menten za pomocą programu Microsoft Excel®

y = ax + b = 4x + 6, 666

$$V_{\max} = \ \frac{1}{b} = \ \frac{1}{6,666} = 0,15$$

$$K_{m} = \ \frac{a}{b} = \ \frac{4}{6,666} = 0,6$$

• Parametry równania Michaelisa-Menten wyznaczone za pomocą programu OriginPro®

Vmax	Odchylenie standardowe
0,15	9,82E-17
Km	Odchylenie standardowe
0,6	1,78E-15

Tabela 2.

Parametry równania Michaelisa-Menten

wynik uzyskany z OriginPro®

• Porównanie wyników uzyskanych z Microsoft Excel® i OriginPro®

	Vmax	Km
Excel^®	0,15	0,6
OriginPro^®	0,15	0,6
Odchylenie standardowe	9,82E-17	1,78E-15

Tabela 3.

Porównanie parametrów równania Michaelisa-Menten

wyniki zebrane z Excel i OriginPro

1. Wnioski

Parametry równania Michaelisa-Menten wyznaczono dwoma metodami obróbki danych doświadczalnych. Uzyskane wyniki są identyczne. Odchylenia standardowe wyznaczone w programie OriginPro® są niskie. Analiza uzyskanych wyników pozwala wnioskować, iż zadane dane (stężenie substratu oraz szybkość reakcji) są bardzo dokładne oraz obie metody są równie dobre do wyznaczania parametrów idealnej kinetyki Michaelisa-Menten. W celu weryfikacji otrzymanych w doświadczeniu danych oraz obliczonych parametrów dokonano doświadczenia w reaktorze okresowym.

1. Weryfikacja w reaktorze okresowym

• Wyznaczenie czasu modelowego (postać całkowa równania Michaelisa-Menten)

$t = \left( \frac{1}{V_{\max}} \right) \bullet (K_{m}\ \bullet ln\frac{\left\lbrack S_{0} \right\rbrack}{\left\lbrack S \right\rbrack} + \ \left\lbrack S_{0} \right\rbrack - \ \lbrack S\rbrack$)

t eksp	Cp	Cs	t model
0	0	30	0,0
1	0,15	29,85	1,0
2	0,3	29,7	2,0
3	0,45	29,55	3,1
5	0,75	29,25	5,1
10	1,5	28,5	10,2
15	2,25	27,75	15,3
20	2,9	27,1	19,7
25	3,7	26,3	25,2
30	4,5	25,5	30,7
40	5,9	24,1	40,2
50	7,3	22,7	49,8
60	8,7	21,3	59,4
79	11,6	18,4	79,3
100	14,6	15,4	100,0
120	17,5	12,5	120,2
150	22	8	152,0
180	25,7	4,3	179,1
196	28	2	197,5
210	29,3	0,7	210,4
219	29,8	0,2	218,7
222	29,9	0,1	222,1
225	29,95	0,05	225,3

Tabela 4.

Dane uzyskane z reaktora okresowego

przy stężeniu początkowym C_S0=30

Legenda:

C_p – stężenie produktu

C_s – stężenie substratu

Wykres 3.

Idealna kinematyka Michaelisa-Menten

Wykres zależności stężenia produktu od czasu

Legenda:

C_p – stężenie produktu

t – czas

Czas eksperymentalny

Czas modelowy

• Weryfikacja danych w programie OriginPro®

	wartość	odchylenie standardowe
Vmax	0,15066	3,96E-04
Km	0,62195	0,01996

Tabela 5.

Parametry po weryfikacji w reaktorze okresowym

• Porównanie parametrów uzyskanych obydwoma metodami

	Vmax	odchylenie standardowe	Km	odchylenie standardowe
metoda "biochemiczna"	0,15	9,82E-17	0,6	1,78E-15
metoda "przemysłowa"	0,15066	3,96E-04	0,62195	0,01996

Tabela 6.

Porównanie parametrów uzyskanych metodą „biochemiczną” i „przemysłową”

1. Wnioski

Czas modelowy dokładnie pokrywa się z czasem eksperymentalnym. Oznacza to, że enzym użyty w doświadczeniu działa zgodnie z założeniami idealnej kinetyki Michaelisa-Menten. Parametry V_max i K_m zaniedbywalnie różnią się porównując metody z jakich zostały wyznaczone. Odchylenia standardowe są niskie, po pozwala na uznanie wyników za prawidłowe.

Dla idealnej kinematyki Michaelisa-Menten zarówno metoda „biochemiczna” jak i „przemysłowa” są odpowiednie do użycia, ponieważ parametry nieznacznie różnią się od siebie, a odchylenia standardowe są zaniedbywalnie niskie. Należy jednak zauważyć, iż w metodzie stosującej regresję liniową błędy są znacznie mniejsze niż kiedy stosowana jest regresja nieliniowa.

1. Inhibicja substratowa w kinetyce Michaelis-Menten

1. Wstęp teoretyczny

Inhibitory są to substancje zmniejszające szybkość katalityczną reakcji. Inhibicję można podzielić na nieodwracalną, prowadzącą do stałej inaktywacji enzymu oraz odwracalną. Tu wyróżniamy inhibitory kompetencyjne, nie kompetencyjne i mieszane. Inhibitory kompetencyjne są zwykle strukturalnie podobne do substratu i współzawodniczą z nim o miejsce aktywne enzymu. Podczas tej inhibicji nie następuje zmiana V_max, ale wartość K_m wzrasta w porównaniu z reakcją bez inhibitora.

Inhibitory niekompetencyjne wiążą się z enzymem w miejscu innym niż miejsce wiązania substratu. Powoduje to zmianę konformacji enzymu, a co za tym idzie zmniejsza jego aktywność katalityczną. Wartość K_m pozostaje stała, jednak wartość V_max zmniejsza się. [2,4]

Rysunek 3. Rysunek 4.

Inhibicja niekompetencyjna [3] Inhibicja kompetencyjna [3]

Jak widać inhibicja ma wpływ na parametry równania Michaelisa-Menten. Dodatkowo pojawia się nowy parametr jakim jest stała dysocjacji inhibitora K_i, którą wyraża się równaniem:

Gdzie: [E]- stężenie enzymu, [I] – stężenie inhibitora, [EI] – stężenie kompleksu inhibitor-enzym

1. Analiza danych doświadczalnych

Cs	r	1/Cs	1/r
0,1	0,021	10,00	46,68
0,2	0,037	5,00	26,69
0,3	0,050	3,33	20,04
0,5	0,068	2,00	14,73
0,8	0,083	1,33	12,10
1,0	0,093	1,00	10,80
1,5	0,105	0,67	9,53
2,0	0,112	0,50	8,93
2,5	0,116	0,40	8,60
3,0	0,119	0,33	8,40
4,0	0,122	0,25	8,20
5,0	0,123	0,20	8,13
7,5	0,122	0,13	8,20
10,0	0,119	0,10	8,40
15,0	0,112	0,07	8,93
20,0	0,105	0,05	9,53
25,0	0,098	0,04	10,16
30,0	0,093	0,03	10,80
35,0	0,087	0,03	11,45
40,0	0,083	0,03	12,10

Tabela 7.

Dane doświadczalne (zadane przez prowadzącą)

Legenda:

C_s – stężenie substratu

r- szybkość reakcji

Wykres 4.

Kinetyka Michaelisa-Menten

z inhibicją substratową

Wykres 5.

Kinetyka Michaelisa-Menten

z inhibicją substratową

wykres odwrotności

• Analiza wykresów

Wykres 4 różni się od wykresu idealnej kinematyki Michaelisa-Menten pokazanej na wykresie 1 co wskazuje na inhibicję. Ponieważ w początkowej fazie reakcji nie uzyskujemy produktu, wskazuje to na inhibicję substratową. Z wykresu 5 odczytujemy, że siła inhibicji wzrasta wraz ze wzrostem stężenia substratu.

• Wyznaczanie parametrów reakcji

W celu wyznaczenia parametrów reakcji korzystamy z warunków początkowych tej reakcji. Konieczne jest przy tym odrzucenie danych od stężenia substratu równego 5. Parametry obliczamy metodą regresji liniowej w programie Excel® oraz regresji nieliniowej w programie OriginPro®. Wykorzystanie danych, przy których inhibicja nie jest jeszcze widoczna pozwala nam wnioskować, że uzyskane parametry będą odbiegać od rzeczywistego stanu reakcji.

Wykres 6.

Kinetyka Michaelisa-Menten z inhibicją substratem w warunkach początkowych

	OriginPro^®	odchylenie standardowe	Excel^®
Vmax	0,15	1,24E-16	0,143
Km	0,6	1,61E-15	0,565
Ki	50	1,57E-13	-

Tabela 8.

Porównanie parametrów równania

Michaelisa-Menten z inhibicją substratową

wyniki zebrane z Excel® i OriginPro®

1. Wnioski

Uzyskane wyniki są wzajemnie porównywalne. Dzięki obliczeniom uzyskaliśmy pierwszą wartość hamowania (K_i). W celu weryfikacji otrzymanych w doświadczeniu danych oraz obliczonych parametrów dokonano doświadczenia w reaktorze okresowym.

1. Weryfikacja w reaktorze okresowym

• Wyznaczanie czasu modelowego (postać całkowa Michaelisa-Menten)

t eksp	Cp	Cs	t model
0	0	30	0,00
2,2	0,15	29,85	1,07
4	0,3	29,7	2,14
6	0,45	29,55	3,21
11	0,75	29,25	5,34
19	1,5	28,5	10,69
26	2,25	27,75	16,04
34	2,9	27,1	20,68
42	3,7	26,3	26,39
52	4,5	25,5	32,11
66	5,9	24,1	42,12
80	7,3	22,7	52,15
97	8,7	21,3	62,19
123	11,6	18,4	83,05
150	14,6	15,4	104,73
176	17,5	12,5	125,84
211	22	8	159,07
239	25,7	4,3	187,40
245	26,5	3,5	193,80
256	27,8	2,2	204,73
260	28,3	1,7	209,24
267	29	1	216,24
273	29,5	0,5	222,47
278	29,8	0,2	228,19

$t = \left( \frac{1}{V_{\max}} \right) \bullet (K_{m}\ \bullet ln\frac{\left\lbrack S_{0} \right\rbrack}{\left\lbrack S \right\rbrack} + \ \left\lbrack S_{0} \right\rbrack - \ \lbrack S\rbrack$)

Tabela 9.

Dane uzyskane z reaktora okresowego

przy stężeniu początkowym C_S0=30

Legenda:

C_p – stężenie produktu

C_s – stężenie substratu

Wykres 7.

kinematyka Michaelisa-Menten z inhibicją substratem

Wykres zależności stężenia produktu od czasu

Legenda:

C_p – stężenie produktu

t – czas

Czas eksperymentalny

Czas modelowy

• Wnioski

Czasy modelowy i doświadczalny na wykresie 7 nie pokrywają się. Pozwala to stwierdzić, że obliczanie czasu modelowego za pomocą postaci całkowej równania Michaelisa-Menten było założeniem błędnym.

• Wyznaczanie czasu modelowego (postać całkowa dla inhibicji substratem)

$$t = \left( \frac{1}{V_{\max}} \right) \bullet (K_{m} \bullet \ln{\frac{\left\lbrack S_{0} \right\rbrack}{\left\lbrack S \right\rbrack} + \ \left\lbrack S_{0} \right\rbrack} - \ \left\lbrack S \right\rbrack + \ \frac{1}{K_{\text{is}}} \bullet \left( {\lbrack S}_{0}\rbrack^{2} - \left\lbrack S \right\rbrack^{2} \right))$$

Wykres 8.

kinematyka Michaelisa-Menten z inhibicją substratem

Wykres zależności stężenia produktu od czasu

Legenda:

C_p – stężenie produktu

t – czas

Czas eksperymentalny

Czas modelowy

• Weryfikacja danych w programie OriginPro®

	wartość	odchylenie standardowe
Vmax	0,1891	0,00534
Km	0,9775	0,11228
Ki	24,9145	1,44952

Tabela 10.

Parametry po weryfikacji w reaktorze okresowym

	Vmax	odchylenie standardowe	Km	odchylenie standardowe	Ki	odchylenie standardowe
metoda "biochemiczna"	0,15	1,24E-16	0,6	1,61E-15	50	1,57E-13
metoda "przemysłowa"	0,1891	0,00534	0,9775	0,11228	24,9145	1,44952

• Porównanie parametrów uzyskanych obiema metodami

Tabela 11.

Porównanie parametrów uzyskanych metodą „biochemiczną” i „przemysłową”

1. Wnioski

Wartości parametrów uzyskane z obu metod znacznie różnią się od siebie. W metodzie „przemysłowej” odchylenia standardowe są bardzo duże, przez co wartości tych parametrów nie mogą być brane pod uwagę. Uzyskane wyniki wskazują, że do obliczana kinetyki reakcji przy inhibicji substratem, nie powinno się używać metody regresji nieliniowej.

1. Kinetyka Michaelisa-Menten z inhibicją produktem

1. Wstęp teoretyczny

Hamowanie reakcji przez produkt końcowy, nazywane sprzężeniem zwrotnym jest podstawowym

mechanizmem regulacji szklaków metabolicznych w komórce. Dostępność produktu sygnalizuje, że dalsza jego synteza jest niepotrzebna i następuje hamowanie szlaku. Ponowne aktywowanie szlaku następuje przy zapotrzebowaniu organizmu na produkt.

1. Analiza danych doświadczalnych

Cs	r	1/Cs	1/r
0,1	0,021	10,0	46,7
0,2	0,038	5,0	26,7
0,3	0,050	3,3	20,0
0,5	0,068	2,0	14,7
0,8	0,083	1,3	12,0
1,0	0,094	1,0	10,7
1,5	0,107	0,7	9,3
2,0	0,115	0,5	8,7
2,5	0,121	0,4	8,3
3,0	0,125	0,3	8,0
4,0	0,130	0,3	7,7
5,0	0,134	0,2	7,5
7,5	0,139	0,1	7,2
10,0	0,142	0,1	7,1
15,0	0,144	0,1	6,9
20,0	0,146	0,1	6,9
30,0	0,147	0,0	6,8
40,0	0,148	0,0	6,8

Tabela 12.

Dane doświadczalne (zadane przez prowadzącą)

Legenda:

C_s – stężenie substratu

r- szybkość reakcji

Wykres 9.

Kinetyka Michaelisa-Menten

z inhibicją produktem

Wykres 10.

Kinetyka Michaelisa-Menten

z inhibicją produktem

wykres odwrotności

	Vmax	Km
Excel^®	0,15	0,6
OriginPro^®	0,15	0,6
Odchylenie standardowe	9,82E-17	1,78E-15

Tabela 13.

Parametry równania Michaelisa-Menten

1. Wnioski

Uzyskane wykresy są identyczne z wykresami idealnej kinetyki Michaelis-Menten (wykres 1 i 2). Pomimo iż, wykresy nie wskazują na inhibicję, należy pamiętać, że pod uwagę bierzemy jedynie początkowe warunki reakcji. Inhibicja produktem zachodzi zaś jedynie w końcowej fazie reakcji. Do przeprowadzenia poprawnej analizy danych doświadczalnych musimy zweryfikować wyniki w reaktorze okresowym, zakładając inhibicję produktem.

1. Weryfikacja w reaktorze okresowym

• Wyznaczanie czasu modelowego (postać całkowa Michaelisa-Menten)

$t = \left( \frac{1}{V_{\max}} \right) \bullet (K_{m}\ \bullet ln\frac{\left\lbrack S_{0} \right\rbrack}{\left\lbrack S \right\rbrack} + \ \left\lbrack S_{0} \right\rbrack - \ \lbrack S\rbrack$)

t eksp	Cp	Cs	t model
0,0	0	30,00	0,0
1,0	0,15	29,85	1,0
2,0	0,3	29,70	2,0
3,1	0,45	29,55	3,1
5,1	0,75	29,25	5,1
10,4	1,5	28,50	10,2
15,8	2,25	27,75	15,3
20,5	2,9	27,10	19,7
26,4	3,7	26,30	25,2
32,5	4,5	25,50	30,7
43,6	5,9	24,10	40,2
55,1	7,3	22,70	49,8
67,2	8,7	21,30	59,4
94,6	11,6	18,40	79,3
127,0	14,6	15,40	100,0
164,0	17,5	12,50	120,2
240,2	22	8,00	152,0
342,0	25,7	4,30	179,1
463,7	28	2,00	197,5
627,5	29,3	0,70	210,4
821,3	29,8	0,20	218,7
928,2	29,9	0,10	222,1
1035,0	29,95	0,05	225,3

Tabela 14.

Dane uzyskane z reaktora okresowego

przy stężeniu początkowym C_S0=30

Legenda:

C_p – stężenie produktu

C_s – stężenie substratu

Wykres 11.

kinematyka Michaelisa-Menten z inhibicją produktem

Wykres zależności stężenia produktu od czasu

Legenda:

C_p – stężenie produktu

t – czas

Czas eksperymentalny

Czas modelowy

• Wnioski

Czas modelowy obliczony zgodnie z metodą całkową kinematyki idealnej Michaelisa-Menten jest założeniem błędnym, co widać na wykresie- czasy nie pokrywają się.

• Wyznaczanie czasu modelowego (postać całkowa dla inhibicji produktem)

$$t = \left( \frac{1}{V_{\max}} \right) \bullet \lbrack\left( K_{m} \bullet \left( 1 + \frac{{\lbrack S}_{0}\rbrack}{\left\lbrack S \right\rbrack} \right) \bullet ln\frac{{\lbrack S}_{0}\rbrack}{\left\lbrack S \right\rbrack} + \left( 1 + \frac{K_{m}}{K_{I}} \right) \bullet \left( {\lbrack S}_{o} \right\rbrack - \ \left\lbrack S \right\rbrack \right)\rbrack$$

Wykres 12.

kinematyka Michaelisa-Menten z inhibicją produktem

Wykres zależności stężenia produktu od czasu

Legenda:

C_p – stężenie produktu

t – czas

Czas eksperymentalny

Czas modelowy

• Weryfikacja danych w programie OriginPro®

	wartość	odchylenie standardowe
Vmax	0,1528	7,87E-11
Km	1,1854	1,60E-08
Ki	1,5907	2,16E-08

Tabela 15.

Parametry po weryfikacji w reaktorze okresowym

• Porównanie parametrów uzyskanych obiema metodami

	Vmax	odchylenie standardowe	Km	odchylenie standardowe	Ki	odchylenie standardowe
metoda "biochemiczna"	0,15	1,24E-16	0,6	1,61E-15	-	-
metoda "przemysłowa"	0,1528	7,87E-11	1,1854	1,60E-08	1,5907	2,16E-08

Tabela 16.

Porównanie parametrów uzyskanych metodą „biochemiczną” i „przemysłową”

1. Wnioski

Odchylenia standardowe w metodzie „przemysłowej” są zaniedbywalnie małe, co pozwalałoby na stwierdzenie, że wyniki te są dobre. Jednak stała K_m znacznie różni się od wyznaczonej w metodzie regresji liniowej. Dodatkowo zaobserwowano, że wprowadzając różne zakresy stałej K_i wyniki były odmienne. Przeprowadzono weryfikacje zmniejszając liczbę parametrów równania. Wiedząc, iż w fazie początkowej reakcji nie zachodzi inhibicja produktem wprowadzono do równania V_max i K_m jako stałe równe kolejno 0,15 i 0,6.

	wartość	odchylenie standardowe
Vmax	0,15	0
Km	0,6	0
Ki	0,8	1,13E-16

Tabela 17.

Parametry kinetyki Michaelisa-Menten przy inhibicji produktem.

Z przeprowadzonego ćwiczenia i po przeprowadzeniu obliczeń stwierdzić można, że do dokładnego oznaczenia parametrów kinetyki reakcji Michaelisa-Menten z hamowaniem produktem, konieczne jest połączenie obydwu poznanych metod, bowiem żadna z nich samodzielnie nie daje rzeczywistych wyników.

1. Literatura

[1] J. Witwicki, Q. Ardelta, „Elementy enzymologii”, PWN, 1989r

[2] J.M.Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, PWN, 2005

[3] http://pl.wikipedia.org/wiki/Enzymy z dnia 12.04.2012, rysunki

[4] Whiteley CG. Enzyme kinetics: partial and complete uncompetitive inhibition. „Biochemical education”. 2000, 28: 144–147,