Sprawozdanie z izolacji genomowego DNA z komórki roślinnej- PETUNIA

W biologii molekularnej znanych jest wiele metod izolacji DNA z badanego materiału roślinnego.

W sprawozdaniu tym porównamy dwie techniki izolowania DNA, a mianowicie:

- metodę z wykorzystaniem buforu CTAB,

- ekstrakcję mieszaniną chloroform/fenol

METODYKI

1. umieść w probówce Eppendorfa 100-200mg materiału roślinnego i rozetrzyj w ciepłym azocie 2. dodaj 400 µl buforu homogenizacyjnego i 25 µl 10% SDS 3. zamieszaj na vortexie 4. wstaw do łaźnie wodnej (65°C) na 45 ° min denaturacja termiczna nukleaz i innych białek 5. Dodaj 67µl 3M octanu potasu (KAc) obniża pH i powoduje wytrącanie SDS wraz z białkami 6. zamieszaj na vortexie 7. Wstaw do lodówki na 40 min 8. Wiruj przy 6000obr/min (w 4°C) przez 10 min. w supernatantcie znajduje się DNA w osadzie pozostałości ściany komórkowej, błony biologicznej, wytrącone białko SDS 9. Przenieś supernatant do innej probówki, a osad wyrzuć 10. Dodaj 800µl mieszaniny fenol/ chloroform/ alkohol izoamylowy (25:24:1) 11. Zamknij probówkę i energicznie zamieszaj 12. Wiruj przy 14000 obr/min (w 4°C) przez 5 min. 13. Ostrożnie przenieś pipetą górną fazę do nowej Epeendorfówki, a resztę wyrzuć 14. Dodać 400 µl chloroformu usunięcie pozostałości fenolu 15. Zamieszaj, wiruj, j.w 16. Górną fazę przenieś pipetą do nowej Eppendorfówki, określ jej objętość 17. Dodaj 2,5-krotną objętość etanolu i delikatnie zamieszaj 18. Wstaw na noc do zamrażalnika(-20°C) 19. Wiruj przy 10000 obr/min (w 4°C) przez 10 min 20. Delikatnie zlej etanol 21. Dodaj taką samą objętość etanolu 80%, jaką masz w Eppendorfówce usunięcie resztek soli i detergentów 22. Delikatnie wymieszaj, wiruj, j.w 23. Po zlaniu etanolu podsusz osad pod próżniąodparowanie etanolu. Nie można dopuścić do całkowitego wyschnięcia DNA 24. Wysuszony osad rozpuść w 50µl buforu TE (bufor o niskiej sile jonowej do przechowywania DNA)

.Umieść w wychłodzonym moździerzu 100-150 mg materiału roślinnego i rozetrzyj na proszek w ciekłym azocie. Odczekaj 1 minutę. .Dodaj 1 ml buforu CTAB i dokładnie rozetrzyj .Przenieś ekstrakt do probówki Eppendorf (2ml) i inkubuj 25 min. w temperaturze 65 °C. W trakcie inkubacji kilkakrotnie zamieszaj probówką. .Po ochłodzeniu probówek dodaj równą objętość mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy(24:1) .Zamknij probówkę i wytrząsaj do utworzenia emulsji. .Wiruj przy 10000obr/min (w 4°C) przez 10 min. .Ostrożnie przenieś pipetą górną fazę do nowej probówki Eppendorf, a resztę wyrzuć .Dodaj zimny etanol(96%) do poziomu pełnej probówki .Delikatnie mieszaj obracając probówkę do momentu aż pojawia się białe kłaczki wytrąconego DNA. .Przygotuj probówkę zawierającą 500 µl roztworu II(75% etanolu, 0.2 M octan sodu). .Nawiń na haczyk lub pobierz obciętą końcówką pipety wytrącony DNA i umieść w roztworze II. .Próbkę inkubuj w temp. Pokojowej 10 min. .Wiruj przy 10000 obr/min (w 4°C) przez 5 min .Usuń roztwór, dodaj 1 ml 75% etanolu, zamieszaj .Wiruj przy 10000 obr/min (w 4°C) przez 1 min .Usuń roztwór, osad lekko osusz. .Dodaj 50 µl buforu TE i rozpuść osad DNA .Przechowaj DNA w - 20°C

OBLICZENIA:

	CTAB	Davis’a
	I próba	II próba
230nm	0,155	0,165
260nm	0,265	0,269
280nm	0,148	0,149

CTAB

Śred. dla 230 nm= 0,160

Śred. dla 260 nm= 0,267

Śred. dla 280 nm= 0,148

Davis

Śred. dla 230 nm= 0,154

Śred. dla 260 nm= 0,225

Śred. dla 280 nm= 0,137

Zawartość wyizolowanego DNA ze wzoru

Zawartość DNA(µg/ml)= A_260nmx rozcieńczenie (100x)x50_{ponieważ 50µg DNA/ml=1}

Zawartość DNA- CTAB= 0,267x 100x50= 1335

Zawartość DNA- Davis= 0,225x100x50= 1125

Czystość wyizolowanego DNA:

Formuła A_260nm/A_280nm :

Dla CTAB= 0,267/0,148= 1,79

Dla Davis’a= 0,225/ 0,137= 1,64

Formuła A_260nm/A_230nm:

Dla CTAB= 0,267/0,160= 1,67

Dla Davis’a= 0,225/ 0,154= 1,45

WNIOSKI:

1. Czystość dla dobrze oczyszczonego DNA wynosi:

1. Dla formuły A_260nm/A_280nm= około 1,8

2. Dla formuły A_260nm/A_230nm= powyżej 1,5

Wyniki naszych obliczeń pokazują, że obie próby z wyizolowanym DNA są dość wysokiej czystości. W przypadku CTABu wartości mieszczą się w standardach, a w przypadku Davis’a wyniki nieznacznie odbiegają od standardu. Dlatego też można wywnioskować, że w przypadku naszego materiału (petunia) metoda CTAB pozwala uzyskać bardziej oczyszczony DNA niż metoda Davis’a.