Izolacja genomowego DNA z krwi ptasiej.

Wykonanie:

• Krew gęsią poddano lizie erytrocytów zamrożenie. Do 20 µl lizatu erytrocytarnego dodano 100 µl buforu wiążącego Binding Buffer.

• Do mieszaniny dodano 500 µl Lysis Buffer i zworteksowano, kolejno dodano 25 µl cząsteczek magnetycznych które uprzednio zostały dokładnie wymieszane. Materiał inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Krew po zmieszaniu z Lysisi Buffer przybrała intensywny czerwono wiśniowy kolor.

• Po inkubacji próbówkę umieszczono w statywie magnetycznym w celu zebrania związanego materiału genetycznego z cząsteczkami magnetycznymi. W wykonywaniu popełniono błąd, koagulat nie został całkowicie rozpuszczony w buforze, ratując naszą próbkę usunęliśmy skrzep z próbki. Gdy cząsteczki magnetyczne zebrały się supernatant został odrzucony.

• Do cząsteczek magnetycznych dodano 1ml PreWash Buffer. Zawartość wymieszano przez kilkukrotne odwrócenie, do chwili całkowitego oderwania się cząsteczek od powierzchni probówki. Inkubowano przez 3 min w temperaturze pokojowej.

• Probówkę ponownie umieszczono w statywie magnetycznym, po zebraniu się cząsteczek magnetycznych odrzucono supernatant.

• Powtórnie dodano 1ml Pre Wash Buffer. Zawartość wymieszano poprzez kilkukrotne jej odwrócenie, następnie inkubowano przez 3 min w temp. pokojowej.

• Po raz kolejny umieszczono próbkę w statywie magnetycznym, po zebraniu się cząsteczek magnetycznych odrzucono supernatant.

• Do cząsteczek magnetycznych dodano 1 ml Wash Buffer. Zawartość próbki wymieszano przez kilkukrotne jej odwrócenie. Inkubowano przez 1 min w temp. pokojowej.

• Probówkę umieszczono w statywie magnetycznym, po zebraniu się cząsteczek magnetycznych odrzucono supernatant.

• Do próbki umieszczonej w statywie magnetycznym dodano 1ml 80% etanolu. Kilkukrotnie odwrócono statyw z umieszczoną probówką w celu wypłukania spod zatyczki pozostałości wcześniej zastosowanych buforów. Pozostawiono na 1 min w temperaturze pokojowej.

• Probówkę umieszczono w statywie magnetycznym, po zebraniu się cząsteczek magnetycznych odrzucono supernatant.

• W celu usunięcia pozostałości etanolu odwrócono statyw z umieszczoną w nim probówką
  i postawiono na bibilu na ok. 5 min.

• Cząsteczki magnetyczne zawieszono przez worteksowanie w 50µl TE Buffer. Mieszaninę inkubowano w temp. 65^oC przez 5 min/ 800rpm.

• Supernatant przeniesiono do nowej probówki maksymalni oczyszczając go z cząsteczek magnetycznych.

Pomiar w NanoDropie - analiza wyników

NanoDrop- to spektrofotometr pozwalający w ciągu kilku sekund określić jakości oraz ilości wyizolowanego materiału biologicznego. Niewielka ilość próby (ok. 1 μl), możliwość pomiaru prób o dużej koncentracji oraz brak konieczności używania kuwet usprawnia i przyspiesza proces analizy badanego materiału. Specjalnie zaprojektowana podstawka do nakładania prób, jest łatwa do czyszczenia i ogranicza prawdopodobieństwo kontaminacji prób. Urządzenie połączone jest z komputerem, co umożliwia obserwowanie uzyskanych wyników na ekranie monitora oraz ich zapisywanie i eksport do plików TXT.

• Na początku NanoDrop skalibrowano, poprzez wykonanie próby ślepej, do wykonania próby ślepej urzyto TE Buffer, to jest ten którym rozcieńczono materiał DNA.

• Wyizolowany materiał genetyczny został poddany pomiarom w NanoDropie, sprawdzono czystość próbki, która została przedstawiona na wykrtesie na ekranie komputerowym.

• Wyniki pomiaru z odczytu NanoDropa:

Wnioski:

Próba JBDA jest próbą czystą, oceniając tylko absorbancję 260/280, współczynnik długości fali 260/280=1.84, Natomiast według współczynnika absorbancji 260/230 dla czystego DNA powinien wynosić 2,2 , natomiast w naszej próbie wyniósł 0,08 co może świadczyć o wysokim stopniu zanieczyszczenia solami, węglowodorami itp.

JBDA		2013-01-14 16:33:56	63,5

Elektroforeza

Do elektroforezy sporządzono 500ml buforu TBE z stężonego 10% buforu TBE. Do czego urzyto 475ml wody redestylowanej, oraz 25ml stężonego 10% buforu TBE.

$x = \ \frac{500*0,5}{10} = 25\left\lbrack \text{ml} \right\rbrack$ - ilość 10% buforu TBE

500-25=475[ml] - ilość wody

Kolejno sporządzono 30ml 1% żelu agarozowego. Do 30ml buforu dodano 0,3 grama agarozy, w celu rozpuszczenia się agarozy w buforze, umieszczono w mijkrofali podgrzewając roztwór mieszano co chwilę, w celu sprawdzenia czy agaroza uległa całkowitemu rozpuszczeniu nie dopuszczając do zagotowania roztworu. Po rzozpuszczeniu agarozy
w buforze i ochłodzeniu do temp. ok 40^oC, dodano 3µl barwnika fluorescesyjnego SybrGreen. Następnie wlano żel do aparatury elektroforetycznej, po czym umieszczono grzebienie w żelu, w celu otrzymania studzienek. Po spolimeryzowaniu żelu, umieszczono go w aparacie elektroforetycznym zalanym buforem TBE. Próbki nakładano w ilości 5µl, po uprzednim przepipetowaniu z buforem obciążającym GX DNA Loading Dye, natomiast markera nałożono 0,5 µl.

Wyników elektroforezy z transiluminatora nie możemy przedstawić, z powodu braku zdjęcia.