Wydzia Chemiczny Politechniki Gda!skiej

Katedra Technologii Leków i Biochemii

Kultury tkankowe i komórkowe ro"lin i zwierz#t

IZOLACJA DNA Z KOMÓREK ZWIERZ$CYCH

Wst%p

Izolacja i oczyszczanie DNA jest kluczowym etapem wi kszo!ci

procedur stosowanych w biologii molekularnej, diagnostyce i innych
badaniach. G"ównym celem tego etapu jest uzyskanie wysokiej jako!ci i
czysto!ci materia"u biologicznego, niezale#nie od $ród"a jego pochodzenia.
Aktualnie dysponujemy bardzo zró#nicowanymi i licznymi metodami
otrzymywania

kwasów

nukleinowych,

od

z"o#onych,

wieloetapowych

procedur, wykorzystuj %cych rozpuszczalniki organiczne do szybszych,
prostszych i bezpieczniejszych. Wybór odpowiedniej metody izolacji zale#y
od rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyska& (DNA
genomowe, mitochondrialne, plazmidowe, RNA itd.), pochodzenia (ro!linne,
zwierz ce,

bakteryjne,

wirusowe

itd.),

rodzaju

materia"u

z

jakiego

przeprowadzamy izolacj (z tkanek, organu, hodowli komórkowej itd.),
oczekiwanych rezultatów (czysto!&, jako!&, czas izolacji itd.) i przeznaczenia
(PCR, klonowanie, blotting, synteza cDNA itd.).

Ogólne zasady izolacji DNA

Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których otrzymuje

si DNA biologicznie aktywny, chemicznie stabilny oraz wolny od RNA i
bia"ek. Jednak#e ze wzgl du na wielko!& i wra#liwo!& chromosomalnego DNA
praktycznie niemo#liwa jest jego izolacja w formie niezmienionej. Cz !&
DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom.

Opracowanie procedury izolacji DNA wymaga szerokiej wiedzy na temat jego

chemicznej stabilno!ci i warunków w jakich znajduje si w swoim naturalnym !rodowisku
(komórka). Czynniki eksperymentalne, które musz% by& wzi te pod uwag i ich wp"yw na
ró#ne aspekty strukturalne natywnego DNA s% zestawione w tabeli 1.

Tabela. 1 Parametry warunkuj%ce zachowanie natywnej struktury DNA podczas izolacji

Lp.

Czynniki

Wp yw na struktur% DNA

1. pH

!wi%zania wodorowe pomi dzy komplementarnymi

"a'cuchami s% stabilne w !rodowisku o pH = 4 ÷ 10,

!wi%zania fosfodiestrowe w szkielecie DNA s% trwa"e w

zakresie pH = 3 ÷ 12,

!wi%zania N-glikozydowe z zasadami purynowymi

(adenin% i guanin%) ulegaj% hydrolizie przy pH < 3;

2. temperatura

!istniej% znaczne ró#nice w stabilno!ci termicznej

wi%za'

wodorowych

w

podwój nej

spirali,

ale

wi kszo!& DNA ulega rozpleceniu w temperaturze 80 ÷

1

Lp.

Czynniki

Wp yw na struktur% DNA

90 °C,

!wi%zania N-glikozydowe i fosfodiestrowe s% trwa"e do

100 °C;

3. si"a jonowa

!DNA jest bardziej trwa"y i rozpuszczalny w

roztworach soli; w st #eniu soli mniejszym ni# 0,1 M
os"abiaj%

si

wi%zania

wodorowe

pomi dzy

komplementarnymi "a'cuchami;

4. warunki

komórkowe

!przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie !ciany

komórkowej (komórki grzybowe, bakteryjne i in.) i
liza b"on komórkowych (komórki zwierz ce i in.);
"atwo!& rozbicia !ciany zale#y od rodzaju organizmu,
w niektórych przypadkach konieczne jest intensywne
ucieranie lub dzia"anie ultrad$wi kami (komórki
dro#d#y, tytoniu), podczas gdy w innych (E. coli)
mo#liwa

jest

enzymatyczna

hydroliza

!ciany

komórkowej,

!w

komórce

wyst puje

kilka

enzymów,

które

hydrolizuj%

DNA;

najistotniejszymi

z

nich

s%

deoksyrybonukleazy,

które

hydrolizuj%

wi%zania

fosfodiestrowe,

!natywny DNA wyst puje w komórkach w kompleksie z

bia"kami (histony, helikazy, polimerazy i in.); bia"ka
te musz% by& oddzielone podczas ekstrakcji;

5. odporno!&

mechaniczna
DNA

!"agodne manipulowanie nie zawsze jest mo#liwe

podczas

izolacji

DNA;

ucieranie,

wytrz%sanie,

mieszanie

i

inne

czynno!ci

mechaniczne

mog%

spowodowa&

rozszczepienie

DNA,

zwykle

nie

powoduje to zniszczenia drugorz dowej struktury
DNA, ale zmniejsza d"ugo!& cz%steczki (fragmentacja).

Etapy izolacji DNA

Niezale#nie od zastosowanej procedury wi kszo!& metod opiera si na

kilku podstawowych i niezmiennych etapach izolacji.

Tabela. 2 Etapy izolacji DNA

Lp.

Etap

Cel etapu i jego przeprowadzenie

1. wst pne przygotowanie

materia"u biologicznego
do izolacji DNA

!oczyszczenie, homogenizacja, zawieszenie w

buforze
Materia"em wyj!ciowym do izolacji DNA mo#e
by& niemal ka#dy materia" biologiczny (tkanka,
organ,

zawiesina

komórkowa

i

in.).

W

zale#no!ci od rodzaju, jak i pochodzenia
materia"u,

wst pne

przygotowanie

mo#e

obejmowa& oczyszczenie z ró#nego rodzaju
zanieczyszcze'

zewn trznych,

po#ywki

i

pozosta"o!ci

innych

komórek

(przemywanie

buforami

stabilizuj%cymi),

rozdrobnienie

i

homogenizacj ,

a

nast pnie

zawieszanie

2

Lp.

Etap

Cel etapu i jego przeprowadzenie

jednolitej masy komórkowej w odpowiednim
buforze.

2. dezintegracja

i liza komórek

!rozbicie !ciany i b"ony komórkowej

Dezintegracj

komórek

prowadzi

si

w

zale#no!ci od rodzaju komórek i tkanek, np.
poprzez

homogenizacj

(mi kkie

tkanki

zwierz ce), sonifikacj (zawiesiny komórek),
rozcieranie (komórki ro!linne, bakteryjne), liz
detergentami (komórki z hodowli komórkowej),
liz

enzymatyczn%

(komórki

bakteryjne,

dro#d#owe) i in.

!uwolnienie

DNA

i

innych

komponentów

wewn%trzkomórkowych do roztworu
Destrukcji

b"on

zewn trznych

towarzyszy

uwolnienie DNA oraz innych komponentów
wewn%trzkomórkowych. St%d bardzo istotne jest
zachowanie odpowiednich warunków, aby kwas
nukleinowy nie uleg" uszkodzeniom.
Do rozpuszczenia DNA i lizy komórek s"u#y
roztwór soli, najcz !ciej NaCl, zawieraj%cy Tris
i EDTA. DNA b d%c zwi%zkiem jonowym jest
bardziej stabilny i rozpuszczalny w roztworze
soli ni# w wodzie destylowanej. Tris ma za
zadanie utrzyma& sta"e pH roztworu (lekko
zasadowe). EDTA wi%#e jony metali Cd

2 +

, Mg

2 +

,

Mn

2 +

, które mog"yby tworzy& sole z anionowymi

grupami fosforanowymi DNA oraz hamuje
dzia"anie deoksyrybonukleaz, które wymagaj%
dla swojej aktywno!ci obecno!ci jonów Mg

2 +

lub

Mn

2 +

.

3. inaktywacja nukleaz

komórkowych

!zabezpieczenie

DNA

przed

enzymami

nukleolitycznymi
Uwalniaj%cy si z komórki kwas nukleinowy jest
nara#ony na dzia"anie degraduj%ce nukleaz –
enzymów katalizuj%cych hydroliz 1- i 2-
niciowych kwasów nukleinowych (endo-, egzo-,
detoksy-, rybonukleazy i in.), przecinaj%cych
wi%zania fosfodiestrowe. Unieczynnienie ich
prowadzi

si

silnymi

enzymami

proteolitycznymi (np. proteinaz% K lub pronaz%).

4. oddzielenie kwasu

nukleinowego od
pozosta"ych
komponentów
komórkowych

!dysocjacja kompleksów DNA-bia"ko

Celem zniesienia oddzia"ywa' jonowych pomi dzy
na"adowanymi dodatnio histonami i innymi bia"kami a
ujemnie na"adowanym szkieletem DNA stosuje si
ró#nego rodzaju detergenty oraz sole. Z czego sól sodowa
siarczanu dodecylu (SDS) wi%#e si z bia"kami i nadaje im
silnie anionowy charakter, a tak#e dzia"a jako czynnik
denaturuj%cy deoksyrybonukleazy i inne bia"ka. (agodnie
alkaliczne

!rodowisko

(pH

=

8,0)

zmniejsza

3

Lp.

Etap

Cel etapu i jego przeprowadzenie

oddzia"ywania

elektrostatyczne

pomi dzy

DNA

a

zasadowymi histonami i polikationowymi aminami,
przyczynia si tak#e do zmniejszenia aktywno!ci nukleaz i
denaturacji innych bia"ek. Za! sole w wysokich st #eniach
(NaCl, NaClO

4

lub inn% sól) zapewniaj% ca"kowit%

dysocjacj

kompleksów

DNA-bia"ko

i usuwaj% zwi%zane kationowe poliaminy;

!oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych

komponentów komórkowych
Ca"kowite

odbia"czanie

roztworu,

przed

wytr%ceniem DNA, przeprowadza si poprzez
ekstrakcj rozpuszczalnikami organicznymi, np.
dzia"aniem

mieszanin%

fenolu

(powoduje

denaturacj bia"ek), chloroformu (powoduje
powierzchniow% denaturacj bia"ek i stabilizuje
granic fazow%, gdzie koncentruje si bia"ko) i
alkoholu izoamylowego (zapobiega parowaniu
chloroformu), a nast pnie odwirowanie.

5. zag szczenie

preparatu DNA i
usuni cie
zanieczyszcze'
ma"ocz%steczkowych

!uzyskanie roztworu DNA o po#%danej czysto!ci i

g sto!ci
Po ekstrakcji kwasy nukleinowe znajduj% si ,
przewa#nie w du#ym rozcie'czeniu, w fazie
wodnej, zanieczyszczonej ma"ocz%steczkowymi
zwi%zkami. Dodaj%c rozpuszczalnik organiczny
(np. etanol lub izopropanol) zmniejsza si
polarno!&

!rodowiska,

co

powoduje

zmniejszenie

rozpuszczalno!ci

DNA,

posiadaj%cego struktur jonow% i DNA tworzy
nitkowate osady, które mo#na zebra& poprzez
odwirowanie.

RNA

w

obecno!ci

alkoholu

etylowego zwykle nie str%ca si tak jak DNA i
wyst puje jedynie jako drobne zanieczyszczenie,
za! przy precypitacji izopropanolem pozostaje
w roztworze. Efektywno!& wytr%cania kwasów
nukleinowych zwi ksza si poprzez dodatek soli
(np.

NaCl,

CH

3

COOH,

LiCl,

MgCl,

czy

CH

3

COONH

4

).

!Po wytr%ceniu i przemyciu 70 % etanolem, DNA

pozostawia si do wyschni cia i nast pnie
zawiesza w ma"ej obj to!ci buforu o niskiej sile
jonowej (np. bufor TE) lub w wodzie.

Materia y i sprz%t

1. Komórki nowotworowe pochodzenia ludzkiego linii HCT-8 (komórki raka

jelita grubego), MOLT4 (komórki bia"aczki) lub innego typu

[5

mln]

2. Bufor lizuj%cy, stosowany podczas izolacji ca"kowitego DNA

komórkowego

4

(10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS; pH 7,4) [1
mln]

3. Bufor TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH 8,0)

[120

µl]

4. Mieszanina chloroform-alkohol izoamylowy (24:1)

[1,2 mln]

5. Roztwór alkoholu etylowego (70 %)

[1

ml]

6. Roztwór alkoholu etylowego (96 %)

[1

ml]

7. Roztwór buforowany PBS (0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH

2

PO

4

,

8,1 mM Na

2

HPO

4

; pH 7,2)

[10

mln]

8. Roztwór NaCl (5 M);

[50

µl]

9. Roztwór RNazyA (1 mg/ml)

[25

µl]

10. Roztwór wodny proteinazy K (1 mg/ml)

[120

µl]

1. Probówka wirówkowa 50 ml z korkiem

[l]

2. Probówki typu Eppendorf 1,5 ml

[6]

3. Pipety automatyczne; 5 ml, 1 ml, 0,1 ml, 0,02 ml

4. Tipsy do pipet automatycznych
5. Wytrz%sarka typu wortex

6. SpeedVac, model 5301 firmy Eppendorf, Niemcy

7. Wirówka, typ 5417 R firmy Eppendorf, Niemcy
8. (a$nia wodna lub termoblok

Wykonanie &wiczenia

Praca w grupach 3 – 4-osobowych
Czas trwania &wiczenia: 3 godziny

!Osad komórek nowotworowych w ilo!ci 5 milionów, uwolniony od

po#ywki

i

2-krotnie przemyty buforem PBS, zawiesi& w 100 µl sterylnego
roztworu TE i przenie!& powsta"% zawiesin do 2 probówek eppendorfa
o obj to!ci 1,5 ml;

!Do ka#dej próbówki doda& po 0,5 ml buforu lizuj%cego oraz 12 l

roztworu RNazy A o st #eniu 1 mg/ml, a nast pnie inkubowa& przez 1
godzin w 37 !C;

!Do lizatu doda& 60 l roztworu proteinazy K o st #eniu 1 mg/ml i

równie# inkubowa& co najmniej przez 1 godzin w 50 !C;

!Po inkubacji roztwór rozcie'czy& wod% do 600 µl i doda& równ%

obj to!& mieszaniny chloroform-alkohol izoamylowy (600 µl) i ca"o!&
miesza&

a#

do

powstania

emulsji

(5 minut na worteksie). Uzyskan% mieszanin rozdzieli& przez
wirowanie
(14000 RPM/25 !C/10 min);

5

!Faz wodn% (500 µl) przenie!& do nowej probówki i doda& równ%

obj to!&

mieszaniny

chloroform-alkohol

izoamylowy,

5

minut

wytrz%sa& i wirowa& jw.;

!Do uzyskanej fazy wodnej (400 µl) doda& roztworu NaCl, do st #enia

ko'cowego
0,3 M (24 µl), dwie obj to!ci zimnego 96 % EtOH (900 µl) i prowadzi&
wytr%canie poprzez kilkukrotne obrócenie probówki do momentu
pojawienia si nitek DNA;

!Wytr%cony DNA zwirowa& (14000 RPM/4 !C/10 min). Supernatant

odrzuci& i osad przep"uka& 1 ml 70 % EtOH i powtórzy& wirowanie;

!Tak uzyskany osad osuszy& za pomoc% SpeedVac w 30 !C przez 5

minut, a nast pnie zawiesi& w 10 l buforu TE, wymiesza&, pozostawi&
w lodówce do nast pnego dnia i po"%czy& oba roztwory wyizolowanego
DNA. Probówk z roztworem DNA przechowywa& w zamra#alniku.

Opracowanie wyników

1) Zapisa& wszystkie obserwacje dotycz%ce procedury oczyszczania.

Wyja!ni& jakiego rodzaju b" dy mog"y zosta& pope"nione i jakiego typu
zanieczyszcze' preparatu DNA mo#na si spodziewa&.

2) Zaproponowa& inne metody izol acji DNA z uwzgl dnieniem rodzaju

materia"u biologicznego i omówieniem zasady izolacji.

Literatura uzupe niaj#ca

[1] Brown T. A.: Genomy, Warszawa: PWN 2001;

[2] Bryszewska M., Leyko W.: Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów,

Warszawa: PWN 2000;

[3] K"yszejko-Stefanowicz L.: wiczenia z biochemii, Warszawa: PWN 1999;

[4] Stryer L.: Biochemia, Warszawa: PWN 2000.

6