Wydział Chemiczny Politechniki Gda

ń

skiej

Katedra Technologii Leków i Biochemii

Kultury tkankowe i komórkowe ro

ś

lin i zwierz

ą

t

Izolacja DNA z komórki zwierz

ę

cej

Izolacja i oczyszczanie DNA jest kluczowym etapem wi

ę

kszo

ś

ci procedur stosowanych

w biologii molekularnej, diagnostyce i innych badaniach. Głównym celem tego etapu jest

uzyskanie wysokiej jako

ś

ci i czysto

ś

ci materiału biologicznego, niezale

ż

nie od

ź

ródła jego

pochodzenia. Wybór odpowiedniej metody izolacji zale

ż

y:

•

od rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyska

ć

(DNA genomowe,

mitochondrialne, plazmidowe, RNA itd.),

•

pochodzenia (ro

ś

linne, zwierz

ę

ce, bakteryjne, wirusowe itd.),

•

rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolacj

ę

(z tkanek, organu, hodowli

komórkowej itd.),

•

oczekiwanych rezultatów (czysto

ść

, jako

ść

, czas izolacji itd.)

•

przeznaczenia (PCR, klonowanie, itd.).

Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których otrzymuje si

ę

DNA:

biologicznie aktywne, chemicznie stabilne oraz wolne od RNA i białek. Jednak

ż

e ze

wzgl

ę

du na wielko

ść

i wra

ż

liwo

ść

chromosomalnego DNA praktycznie niemo

ż

liwa jest jego

izolacja w formie niezmienionej. Cz

ęść

DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom.

Podczas izolacji DNA z komórki nale

ż

y wzi

ąć

pod uwag

ę

nast

ę

puj

ą

ce parametry,

warunkuj

ą

ce zachowanie natywnej struktury DNA:

1. ph:

•

wi

ą

zania

wodorowe

pomi

ę

dzy komplementarnymi ła

ń

cuchami s

ą

stabilne

w

ś

rodowisku o pH = 4 ÷ 10

•

wi

ą

zania fosfodiestrowe w szkielecie DNA s

ą

trwałe w zakresie pH = 3 ÷ 12

•

wi

ą

zania N-glikozydowe z zasadami purynowymi (adenin

ą

i guanin

ą

) ulegaj

ą

hydrolizie przy pH < 3

2. temperatura:

•

istniej

ą

znaczne ró

ż

nice w stabilno

ś

ci termicznej wi

ą

za

ń

wodorowych w podwójnej

spirali, ale wi

ę

kszo

ść

DNA ulega rozpleceniu w temperaturze 80÷90 °C

•

wi

ą

zania N-glikozydowe i fosfodiestrowe s

ą

trwałe do 100°C

3. siła jonowa :

•

DNA jest bardziej trwały i rozpuszczalny w roztworach soli

•

w st

ęż

eniu soli mniejszym ni

ż

0,1M osłabiaj

ą

si

ę

wi

ą

zania wodorowe pomi

ę

dzy

komplementarnymi ła

ń

cuchami;

4. warunki komórkowe:

•

przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie

ś

ciany komórkowej (komórki

grzybowe, bakteryjne i in.) i liza błon komórkowych (komórki zwierz

ę

ce i in.);

łatwo

ść

rozbicia

ś

ciany zale

ż

y od rodzaju organizmu, w niektórych przypadkach

konieczne jest intensywne ucieranie lub działanie ultrad

ź

wi

ę

kami (komórki dro

ż

d

ż

y,

tytoniu), podczas gdy w innych (E. coli) mo

ż

liwa jest enzymatyczna hydroliza

ś

ciany

komórkowej

•

w komórce wyst

ę

puje kilka enzymów, które hydrolizuj

ą

DNA; najistotniejszymi z nich

s

ą

deoksyrybonukleazy, które hydrolizuj

ą

wi

ą

zania fosfodiestrowe

•

natywny DNA wyst

ę

puje w komórkach w kompleksie z białkami (histony, helikazy,

polimerazy i in.), białka te musz

ą

by

ć

oddzielone podczas ekstrakcji;

5. odporno

ść

mechaniczna DNA:

•

łagodne manipulowanie nie zawsze jest mo

ż

liwe podczas izolacji DNA; ucieranie,

wytrz

ą

sanie, mieszanie i inne czynno

ś

ci mechaniczne mog

ą

spowodowa

ć

rozszczepienie DNA, zwykle nie powoduje to zniszczenia drugorz

ę

dowej struktury

DNA, ale zmniejsza długo

ść

cz

ą

steczki (fragmentacja).

Etapy izolacji DNA

Niezale

ż

nie od zastosowanej procedury wi

ę

kszo

ść

metod opiera si

ę

na kilku

podstawowych i niezmiennych etapach izolacji:

Etap 1. Wst

ę

pne przygotowanie materiału biologicznego do izolacji DNA

oczyszczenie, homogenizacja, zawieszenie w buforze

Materiałem wyj

ś

ciowym do izolacji DNA mo

ż

e by

ć

niemal ka

ż

dy materiał biologiczny

(tkanka, organ, zawiesina komórkowa i in.). W zale

ż

no

ś

ci od rodzaju, jak i pochodzenia

materiału, wst

ę

pne przygotowanie mo

ż

e obejmowa

ć

oczyszczenie z ró

ż

nego rodzaju

zanieczyszcze

ń

zewn

ę

trznych, po

ż

ywki i pozostało

ś

ci innych komórek (przemywanie

buforami stabilizuj

ą

cymi ), rozdrobnienie i homogenizacj

ę

, a nast

ę

pnie zawieszanie

jednolitej masy komórkowej w odpowiednim buforze.

Etap 2. Dezintegracja i liza komórek oraz uwolnienie DNA do roztworu, w którym jest

on rozpuszczalny i zabezpieczony przed degradacj

ą

rozbicie

ś

ciany i błony komórkowej

Dezintegracj

ę

komórek prowadzi si

ę

w zale

ż

no

ś

ci od rodzaju komórek i tkanek, np. poprzez

homogenizacj

ę

(mi

ę

kkie tkanki zwierz

ę

ce), sonifikacj

ę

(zawiesiny komórek), rozcieranie

(komórki ro

ś

linne, bakteryjne), liz

ę

detergentami (komórki z hodowli komórkowej), liz

ę

enzymatyczn

ą

(komórki bakteryjne, dro

ż

d

ż

owe)

uwolnienie DNA i innych komponentów wewn

ą

trzkomórkowych do roztworu

Destrukcji błon zewn

ę

trznych towarzyszy uwolnienie DNA oraz innych komponentów

wewn

ą

trzkomórkowych. St

ą

d bardzo istotne jest zachowanie odpowiednich warunków, aby

kwas nukleinowy nie uległ uszkodzeniom. Do rozpuszczenia DNA i lizy komórek słu

ż

y

roztwór soli, najcz

ęś

ciej NaCl, zawieraj

ą

cy Tris-HCl i EDTA. DNA, b

ę

d

ą

c zwi

ą

zkiem

jonowym jest bardziej stabilny i rozpuszczalny w roztworze NaCl ni

ż

w wodzie destylowanej.

Tris-HCl ma za zadanie utrzyma

ć

stałe, lekko zasadowe pH roztworu, co zmniejsza

oddziaływania elektrostatyczne pomi

ę

dzy DNA a zasadowymi białkami. EDTA wi

ąż

e jony

metali Cd

2+

, Mg

2+

,Mn

2+

, które mogłyby tworzy

ć

sole z anionowymi grupami fosforanowymi

DNA oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz, które wymagaj

ą

dla swojej aktywno

ś

ci

obecno

ś

ci jonów Mg

2+

lub Mn

2+

.

inaktywacja enzymów nukleolitycznych

Uwalniaj

ą

cy si

ę

z komórki kwas nukleinowy jest nara

ż

ony na działanie degraduj

ą

ce nukleaz

– enzymów katalizuj

ą

cych hydroliz

ę

1- i 2-niciowych kwasów nukleinowych (endo-, egzo-,

detoksy-, rybonukleazy i in.), przecinaj

ą

cych wi

ą

zania fosfodiestrowe. Unieczynnienie ich

prowadzi si

ę

silnymi enzymami proteolitycznymi (np. proteinaz

ą

K).

Etap 3. oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów komórkowych

dysocjacja kompleksów DNA – białko

Celem zniesienia oddziaływa

ń

jonowych pomi

ę

dzy naładowanymi dodatnio histonami

i innymi białkami a ujemnie naładowanym szkieletem DNA stosuje si

ę

ró

ż

nego rodzaju

detergenty oraz sole. Sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) wi

ąż

e si

ę

z białkami i nadaje im

silnie anionowy charakter, a tak

ż

e działa jako czynnik denaturuj

ą

cy deoksyrybonukleazy

i inne białka. Łagodnie alkaliczne

ś

rodowisko (pH = 8,0) zmniejsza oddziaływania

elektrostatyczne pomi

ę

dzy DNA a zasadowymi histonami i polikationowymi aminami,

przyczynia si

ę

tak

ż

e do zmniejszenia aktywno

ś

ci nukleaz i denaturacji innych białek. Za

ś

sole w wysokich st

ęż

eniach (NaCl, NaClO4 lub inn

ą

sól) zapewniaj

ą

całkowit

ą

dysocjacj

ę

kompleksów DNA-białko i usuwaj

ą

zwi

ą

zane kationowe poliaminy;

oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych komponentów komórkowych

Całkowite odbiałczanie roztworu, przeprowadza si

ę

poprzez ekstrakcj

ę

rozpuszczalnikami

organicznymi, np. mieszanin

ą

chloroformu i alkoholu izoamylowego, a nast

ę

pnie

odwirowanie. W rezultacie powstaj

ą

trzy warstwy: górna faza wodna, zawieraj

ą

c

ą

kwasy

nukleinowe, dolna faza organiczna i w

ą

skie pasmo zdenaturowanego białka na granicy faz.

Chloroform powoduje powierzchniow

ą

denaturacj

ę

białek. Alkohol izoamylowy redukuje

pienienie i stabilizuje granic

ę

fazow

ą

, gdzie koncentruje si

ę

białko. Górna, wodna faza,

zawieraj

ą

ca kwasy nukleinowe jest nast

ę

pnie oddzielana i DNA jest wytr

ą

cany poprzez

dodanie etanolu.

Etap

4.

zag

ę

szczenie

preparatu

DNA

i

usuni

ę

cie

zanieczyszcze

ń

małocz

ą

steczkowych

uzyskanie roztworu DNA o po

żą

danej czysto

ś

ci i g

ę

sto

ś

ci

Po ekstrakcji kwasy nukleinowe znajduj

ą

si

ę

, przewa

ż

nie w du

ż

ym rozcie

ń

czeniu, w fazie

wodnej, zanieczyszczonej małocz

ą

steczkowymi zwi

ą

zkami. Dodaj

ą

c rozpuszczalnik

organiczny (np. etanol lub izopropanol) zmniejsza si

ę

polarno

ść

ś

rodowiska, co powoduje

zmniejszenie rozpuszczalno

ś

ci DNA, posiadaj

ą

cego struktur

ę

jonow

ą

i DNA tworzy

nitkowate osady, które mo

ż

na zebra

ć

poprzez odwirowanie. RNA w obecno

ś

ci alkoholu

etylowego zwykle nie str

ą

ca si

ę

tak jak DNA i wyst

ę

puje jedynie jako drobne

zanieczyszczenie, za

ś

przy precypitacji izopropanolem pozostaje w roztworze. Efektywno

ść

wytr

ą

cania kwasów nukleinowych zwi

ę

ksza si

ę

poprzez dodatek soli (np. NaCl, CH

3

COOH,

LiCl, MgCl, czy CH

3

COONH

4

).

Po wytr

ą

ceniu i przemyciu 70 % etanolem, DNA pozostawia si

ę

do wyschni

ę

cia i nast

ę

pnie

zawiesza w małej obj

ę

to

ś

ci buforu o niskiej sile jonowej (np. bufor TE) lub w wodzie.

Wykonanie

ć

wiczenia

Celem

ć

wiczenia jest izolacja DNA z komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego.

Materiały i sprz

ę

t

Zestaw do izolacji DNA z tkanek i linii komórkowych Genomic Mini AX Tissue

(A&A Biotechnology).

Materiały i sprz

ę

t:

•

komórki nowotworowe

1x10

6

•

70% EtOH

0,5ml

•

bufor TE

0,1ml

•

probówki Eppendorfa

•

probówki 15ml z kolumn

ą

•

pipety automatyczne

•

wirówka Eppendorfa 12 000 – 14 000 obr/min

•

termoblok

•

worteks

Izolacja DNA z wykorzystaniem zestawu Genomic Mini AX Tissue (A&A Biotechnology)

1. Do pelletu komórek nowotworowych doda

ć

0,9ml zawiesiny lizuj

ą

cej LS (

uwaga

:

zawiesin

ę

nale

ż

y wymiesza

ć

przez kilkukrotne odwracanie butelki) oraz 40µl Proteazy

LS składa si

ę

z:

Tritonu X-100

Chlorowodorku guanidyny

Bufor MOPS

2. Cało

ść

wymiesza

ć

i inkubowa

ć

w 50°C przez 30 min. Probówk

ę

nale

ż

y miesza

ć

od

czasu do czasu przez worteksowanie.

3. Po inkubacji próbk

ę

intensywnie worteksowa

ć

przez 15 sek., a nast

ę

pnie wirowa

ć

5 min.

przy 10 000 – 14 000 obr./min.

4. Podczas wirowania nanie

ść

na kolumn

ę

0,8ml roztworu równowa

ż

acego K1. Poczeka

ć

a

ż

roztwór wypłynie z kolumny.

5. Pobra

ć

supernatant

(na dnie powinien znajdowa

ć

si

ę

zwarty osad stanowi

ą

cy mieszanin

ę

niezlizowanego materiału oraz drobinek pochodz

ą

cych z mieszaniny lizuj

ą

cej)

i nanie

ść

go na kolumn

ę

umieszczon

ą

w probówce 15 ml. Poczeka

ć

a

ż

lizat przejdzie przez

kolumn

ę

.

6. Nast

ę

pnie dwukrotnie przepłuka

ć

kolumn

ę

przez dodanie 1,5 ml roztworu płucz

ą

cego

K2. Za ka

ż

dym razem poczeka

ć

a

ż

roztwór wypłynie z kolumny.

Skład roztworu K2:

0,8M NaCl

15% izopropanol

Bufor MOPS

7. Doda

ć

do kolumny 0,25 ml roztworu elucyjnego K3 i poczeka

ć

a

ż

wypłynie z kolumny

(krok ten ma na celu zmniejszenie całkowitej obj

ę

to

ś

ci eluatu, gdy

ż

martwa obj

ę

to

ść

kolumny wynosi 0,3ml)

.

Skład roztworu K3:

1,2M NaCl

15% izopropanol

bufor Tris-HCl, pH=8,0

8. Przenie

ść

kolumn

ę

do nowej probówki 2 ml, która posiada odpowiednie

ż

eberka

pozwalaj

ą

ce na łatwe umieszczenie w probówce i eluowa

ć

DNA przez dodanie do

kolumny 1 ml roztworu elucyjnego K3.

9. Do eluatu zwieraj

ą

cego DNA doda

ć

0,8 ml mieszaniny precypitacyjnej PM. Cało

ść

wymiesza

ć

i wirowa

ć

10 min. przy 12 000 obr./min (

uwaga

: roztwór PM zawiera

dodatkowo wzmacniacz precypitacji, dlatego przed u

ż

yciem nale

ż

y go wymiesza

ć

przez

kilkukrotne odwracanie butelki).

Skład PM:

izopropanol

akrylami liniowy (wzmacniacz precypitacji)

10. Po odwirowaniu zla

ć

supernatant (

na dnie powinien by

ć

widoczny jasnoniebieski osad

DNA)

i doda

ć

do probówki 0,5 ml 70% EtOH, w celu wytr

ą

cenia DNA. Próbk

ę

wymiesza

ć

i wirowa

ć

3 min. przy 12 000 obr./min.

11. Po odwirowaniu zla

ć

supernatant i trzymaj

ą

c probówk

ę

w pozycji odwróconej, przytkn

ąć

sam

ą

ko

ń

cówk

ę

pipety (bez pipety) do dna i

ś

cianek probówki celem kapilarnego

usuni

ę

cia resztek alkoholu. Nast

ę

pnie suszy

ć

odwrócon

ą

do góry dnem probówk

ę

przez

5 min. w temp. pokojowej.

12. Osad zawiesi

ć

w 20

µ

l buforu TE

(niebieska barwa osadu pozwala kontrolowa

ć

proces

rozpuszczania DNA)

.

OPRACOWANIE WYNIKÓW

1. Opisa

ć

procedur

ę

izolacji DNA z komórki zwierz

ę

cej i wyja

ś

ni

ć

cel ka

ż

dego etapu

i rol

ę

ka

ż

dego odczynnika.

2.

Scharakteryzowa

ć

inny ni

ż

Arabidopsis thaliana ro

ś

linny organizm modelowy.

3.

Wymieni

ć

główne ró

ż

nice mi

ę

dzy genomem komórki ro

ś

linnej i zwierz

ę

cej.

Literatura uzupełniaj

ą

ca

1. Brown TA. Genomy. Warszawa, PWN 2001

2. Bryszewska M, Leyko W. Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów. Warszawa: PWN

2000

3. Kłyszejko – Stefanowicz L.

Ć

wiczenia z biochemi. Warszawa, PWN 1999

4. Stryer L. Biochemia. Warszawa, PWN 2000.