SPRAWOZDANIE 19.03.2009r

Katarzyna Piaskowy

Biotechnologia, Grupa Chem2, sekcja 8

Temat: Izolacja DNA z hodowanych komórek eukariotycznych.

Cel ćwiczenia: Wyizolowanie DNA z komórek HCT 116

Wstęp teoretyczny:

Izolacja DNA to jeden z najważniejszych procesów w biologii molekularnej. Jest zasadniczym etapem wielu eksperymentów m.in. PCR-u czy konstrukcji bibliotek genomowych. Znanych jest wiele metod izolacji DNA, aby wybrać którąś z nich należy uwzględnić rodzaj/pochodzenie (czy jest to komórka zwierzęca, roślinna, organellum) a także przeznaczenie wyizolowanego DNA-czyli jaka ilość i jakość konieczna jest do dalszego jego wykorzystania.

Izolacja DNA polega na usunięciu z komórek wszystkich pozostałych związków.

Na początku należy zniszczyć integralność błony komórkowej (używamy do tego wysokich stężeń soli, detergentów). Następnie zawartość komórek trawiona jest enzymami proteolitycznymi w środowisku hamującym aktywność enzymów nukleolitycznych, i denaturującym białka (EDTA, Mg²⁺, SDS, proteinaza K). Proteinaza K to niespecyficzna (trawi liczne białka bez względu na ich sekwencję) proteaza serynowa, jest dość odporna na działanie niskich stężeń detergentów, niestety nie trawi ona białek do pojedynczych aminokwasów, dlatego musimy przeprowadzić następny etap tzw. odbiałczanie (usunięcie niestrawionych białek i peptydów za pomocą substancji powodujących denaturację i wytrącanie białek). Po tym procesie w zawiesinie pozostają tylko drobnocząsteczkowe zanieczyszczenia i kwasy nukleinowe, ich usunięcie jest możliwe dzięki wytrącaniu DNA z roztworu przy pomocy alkoholu etylowego, który przy niskim pH r-ru ułatwia wypadanie DNA z r-ru. Wytrącony DNA można potem odwirować, wysuszyć i umieścić w niewielkiej ilości wody lub buforu TE.

Substancje/materiały/odczynniki potrzebne do izolacji DNA:

• Komórki HTC 116-komórki ludzkiego raka okrężnicy, mają zmutowany allel (K-RAS) , cechują się słabą adhezją i znaczną migracją w warunkach in vitro.

• Bufor do ekstrakcji-(3M NaCl, 0,4M Tris:HCl pH 7,8, 20 mM EDTA)-powoduje homogenizację roztworu.

• SDS-detergent, tworzy środowisko denaturujące białka, powoduje rozpad błony komórkowej.

• EDTA-(kwas etylenodiaminotetraoctowy ) związek który wiąże jony metali dwuwartościowych (szczególnie Mg²⁺, które hamują aktywność nukleaz).

• Proteinaza K-niespecyficzna proteaza serynowa wydzielana przez kultury niektórych śluzowców, łatwo inaktywuje DNazy i nie traci aktywności w mieszaninach detergentów. Nie trawi białek do pojedynczych aminokwasów.

• Fenol:chloroform-odbiałczają DNA, cięższe od wody, pozostawiają w roztworze kwasy nukleinowe i drobnocząsteczkowe zanieczyszczenia, natomiast powodują wytrącanie białek, które zbierają się na granicy faz, pomiędzy fazą wodną i organiczną. Kilkakrotne traktowanie tymi związkami zanieczyszczonych białkami roztworów DNA może usunąć większość białkowych zanieczyszczeń.

• Bufor Tris:HCl pH 6,7-służy do zapewnienia odpowiedniego środowiska.

• Bufor TE-(10 mM Tris:HCl 7,8 1mM EDTA)-utrzymuje stałe pH

• Alkohol etylowy odwadnia DNA, co w roztworze o niskim pH znakomicie ułatwia wypadanie kwasu nukleinowego z roztworu.

• Octan sodu- zwiększa wydajność alkoholu.

Przebieg ćwiczenia:

1.Liza komórki, wytrawienie białek.

Na początku do otrzymanych komórek HCT 116 dodałyśmy 400 μl buforu do ekstrakcji, 8μl 20 % SDS w celu przeprowadzenia lizy komórek, całość wymieszałyśmy za pomocą wortexu. Nie rozmrażaliśmy komórek w lodzie, ponieważ nie potrzebowaliśmy ich w całości (mogły popękać). Następnie prowadzący dodał 2μl proteinazy K. W roztworze pojawiły się białe „drobinki”, grudki. Po wymieszaniu wstawiłyśmy próbówkę na jedną godzinę do termobloku (55 °C).

2.Odbiałczanie.

Po wyjęciu roztworu z termobloku dodałyśmy 400μl mieszany fenol-chloroform i przez 30 sekund worteksowałyśmy, a następnie włożyłyśmy do wirówki na 2 minuty -1400 obrotów/min. Po wyjęciu eppendorfki z wirówki zauważyłyśmy biały osad, więc czynność powtórzyłyśmy: delikatnie zebrałyśmy górną warstwę do nowej próbówki i dodałyśmy mieszaninę fenol-chloroform i włożyłyśmy do wirówki. Dopiero za trzecim razem otrzymałyśmy oczekiwaną konsystencję-górna warstwa-potrzebny roztwór DNA-pierścień- warstwa dolna mieszanina chloroformu i fenolu. (dopiero wtedy nie było widać dużej ilości „kłębka” białkowego).

Zebrałyśmy górną warstwę o objętości 230μl i dodałyśmy tą samą objętość mieszaniny chloroform-alkohol izoamylowy, wytrząsałyśmy przez 30 s i zwirowałyśmy 14 000 obrotów na min. Po zwirowaniu zebrałyśmy fazę wodną-górną warstwę znajdującą się w próbówce do nowej eppendorfki (wszystkie czynności związane z dodawaniem chloroformu, fenolu, alkoholu izoamylowego wykonałyśmy pod dygestorium).

3.Wytrącanie DNA

Za pomocą pipety znów zmierzyłyśmy objętość fazy wodnej. Ustawiłyśmy pipetę na 100μl (później coraz mniejsze objętości) i przelewałyśmy roztwór z jednej próbówki do drugiej, licząc ile μl mamy, następnie zsumowałyśmy wyniki i otrzymałyśmy 147μl roztworu. Dodałyśmy 253 μl (aby objętość r-ru wynosiła 400μl). Następnie dodałyśmy 40μl 3 M octanu sodu (aby zwiększyć pH roztworu) oraz 2 objętości (880 μl) 96% zimnego alkoholu etylowego. Całą mieszaninę wstawiłyśmy na 20 minut do zamrażarki do temperatury -20°, następnie przez 20 minut wirowałyśmy w wirówce w szafie chłodniczej 14 000 0br/min.

Po 20 minutach delikatnie aby nie uszkodzić DNA ściągałyśmy supernatant. Pozostałą cześć przepłukałyśmy 100μl zimnego 70 % alkoholu, znów włożyłyśmy próbówkę do wirówki tym razem na 5 minut (1400 obr/min). Następnie zebrałyśmy nasącz (odrzuciłyśmy go) a pozostały osad suszyłyśmy przez około 15 minut, aż zawartość próbówki wydawała się sucha i nie czuć było zapachu alkoholu, po tym czasie zawiesiłyśmy substancję w 50μl buforu TE. Naszą próbkę pozostawiłyśmy w szafie chłodniczej.

Wnioski:

Izolacja to trudny, pracochłonny i skomplikowany proces, wymaga dokładności i precyzji, bardzo łatwo o błąd i zniszczenie materiału badawczego. Równocześnie z DNA wyizolowałyśmy RNA, ponieważ oba kwasy mają podobne właściwości, usunięcie RNA wymagałoby dodatkowego trawienia oczyszczonego roztworu RNazą, czego nie zrobiłyśmy, ale dzięki temu będziemy mogły sprawdzić jakość wyizolowanego DNA.

Wyizolowałyśmy bardzo małą ilość materiału, być może dlatego, że aż trzy razy musiałyśmy powtarzać samo odbiałczanie lub z powodu naszych błędów, nie wiadomo jeszcze czy wszystkie czynności wykonałyśmy poprawnie, ponieważ na tym etapie doświadczenia nie możemy nawet stwierdzić czy jest to DNA, które chciałyśmy otrzymać, być może są to jakieś inne substancje lub zanieczyszczenia.