mgr Anna Korycińska

[e-mail]

Obecnie wykorzystywane metody
izolacji:



Zastosowanie mieszaniny fenol:chloroform



Wysalanie białek



Wiązanie DNA do nośnika

Wybór odpowiedniej metody
zależy od:



Rodzaju materiału genetycznego jaki chcemy uzyskać
(DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe,
RNA, itp.)



Pochodzenia (roślinne, zwierzęce, bakteryjne,
wirusowe, itp.)



Rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolację
(z tkanek, organu, hodowli komórkowej)



Oczekiwanych rezultatów (czystość, jakość, czas
izolacji)



Przeznaczenia (PCR, klonowanie)

Porównanie metod

Fenol: chloroform

wysalanie

nośnik

zalety

Otrzymane DNA jest
wysokiej czystości

Nie narusza
struktury białek, jest
odwracalne

Prostota, szybkość,
wydajność

wady

Konieczne jest
utrzymanie
odpowiedniego pH

Powolność procesu

Niższa wydajność
niż w przypadku
izolacji
fenol:chloroform

Etapy izolacji DNA

1.

Przygotowanie materiału biologicznego



Oczyszczenie (z zewnętrznych zanieczyszczeń,
pożywki i pozostałości innych komórek)



Homogenizacja



Zawieszenie w buforze

Etapy izolacji DNA

2. Dezintegracja i liza komórek oraz uwolnienie DNA do

roztworu oraz zabezpieczenie DNA przez degradacją.



Rozbicie ściany i błony komórkowej



Uwolnienie DNA i innych komponentów
wewnątrzkomórkowych do roztworu



Inaktywacja enzymów nukleolitycznych

Etapy izolacji DNA

3. Oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych

komponentów komórkowych



Dysocjacja kompleksów DNA-białko



Oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych
komponentów komórkowych

Etapy izolacji DNA

4. Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie

zanieczyszczeń małocząsteczkowych



Uzyskanie roztworu DNA o pożądanej czystości i
gęstości

Metoda fenolowa

Izolacja DNA metodą fenolową

1.

liza komórek i oddzielenie białek od DNA- dodanie
krwi do fenolu

-

Fenol denaturuje białka

-

Nie denaturuje całkowicie RNaz

-

Jest rozpuszczalnikiem dla RNA



Dodanie fenolu, wytrząsanie, wirowanie

Faza wodna:
DNA

Interfaza:
białka

Faza
organiczna:
tłuszcze i RNA

Izolacja DNA metodą fenolową

2. Dalsze oczyszczanie z białek

-

Mieszanina fenol/chloroform/ alkohol izoamylowy
25/24/1

-

Chloroform ułatwia rozdzielenie fazy wodnej i
organicznej

-

Inaktywacja i usunięcie enzymów

Izolacja DNA metodą fenolową

3. Usuwanie fenolu

-

Resztki fenolu usuwa się poprzez dodanie samego
chloroformu do zebranej fazy wodnej

4. Wytrącanie DNA

-

Dodanie izopropanolu do fazy wodnej

-

Po wirowaniu DNA jest w osadzie na dnie probówki.

Izolacja DNA metodą fenolową

5. Przemycie DNA

-

Dodanie etanolu 70%

-

Wirowanie

-

Pozostawienie do wyschnięcia

6. Rozpuszczenie osadu DNA

-

Dodanie roztworu o niskiej sile jonowej- woda lub
bufor TE

Izolacja metodą kolumienkową

Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych



Krew jest lizowana o odpowiednim buforze lizującym,
który zawiera sole chaotropowe i detergenty niejonowe



Dodatkowo wykorzystuje się Proteinazę K (silna
proteaza) – liza komórek i degradacja wszystkich
białek.

Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych



Następnie mieszanina nakładana jest na kolumnę ze
złożem krzemionkowym – DNA osiada na złożu,
zanieczyszczenia przechodzą przez nie

Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych



W tej metodzie izolacji wykorzystuje się wiązanie
DNA do złoża krzemionkowego w wysokim stężeniu
soli chaotropowych. Ujemnie naładowane cząsteczki
DNA łączą się w dużym stężeniu soli do dodatnio
naładowanej krzemionki. Zanieczyszczenia są
odpłukiwane, a następnie DNA wymywany jest
roztworem o niskim stężeniu soli (woda lub bufor w
niskim stężeniu)

Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych



Po wypłukaniu zanieczyszczeń DNA wymywane jest z
kolumny niskojonowymi buforami lub wodą.

Izolacja DNA na złożach
krzemionkowych

Ocena ilościowa i jakościowa DNA

Ocena ilościowa wyizolowanego
DNA

Absorbancja przy 260nm jest równa 1 dla:



dwuniciowego DNA o stężeniu 50μg/ml,

Stężenie= Abs(260nm-310nm) x 50μg/ml x rozc



jednoniciowego DNA o stężeniu 33μg/ml

Ocena jakościowa wyizolowanego
DNA



Zmierzenie absorbancji przy długości fali: 260nm,
280nm,320nm



Stosunek absorbancji A260/A280 określa stopień
zanieczyszczenia białkami. DNA uważamy za czyste,
jeżeli ten stosunek wynosi 1,8-2,05



Stosunek 1,5 oznacza, że w preparacie znajduje się 50%
białka i preparat należy ponownie oczyścić.

Ocena jakościowa wyizolowanego
DNA



Substancje absorbujące i charakterystyczne dla nich
długości fali.



Zanieczyszczenie fenolem:

230



DNA, RNA:

260



Białka:

280



Drobiny komórkowe:

320

Dodatkowe materiały



Dodatkowe materiały znajdują się na stronie e-kursu