TWORZENIE KONSTRUKTU PLAZMIN Z GENEM GFP + GEN BADANY

Etapy:

1. Wybór genu

2. Wybór plazmidu zawierającego gen białka fluorescencyjnego odpowiedniego dla danego organizmu

3. Wybór enzymów restrykcyjnych, które tną plazmid, ale nie tną wstawki.

4. Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji sekwencji kodującej

5. Zaplanowanie reakcji PCR

6. Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego osobno dla badanego genu i plazmidu

7. Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia sekwencji badanego genu z plazmidem

ETAP I - Wybór genu

• do reakcji używamy tylko cDNA

• sekwencje UTR (sekwencje 3’ i 5’ nietranslatowane) znajdują się przed kodonem START i za kodonem STOP w sekwencjach kodujących

ETAP 2 – Wybór plazmidu zawierającego gen białka fluorescencyjnego odpowiedniego dla danego organizmu

ETAP 3 – Wybór enzymów restrykcyjnych, które tną plazmid, ale nie tną wstawki.

• Powinny wycinać duży fragment MSC, czyli wybieramy te enzymy znajdujące się jak najdalej od siebie.

• W celu sprawdzenia czy dany enzym restrykcyjny, który tnie plazmid nie tnie wstawki sekwencję kodującą genu należy wstawić do „Restriction Mapper” lub http://tools.neb.com/NEBcutter2

ETAP 4 – Zaplanowanie odpowiednich starterów

• jeżeli wstawiany gen znajdzie się przed genem białka fluorescencyjnego (w wektorach typu N) przy tworzeniu startera wstecznego omijamy kodon STOP i pierwszym nukleotydem w starterze jest ten po kodonie stop.

• Starter forward musi zaczynać się od kodonu START (ATG)

• Optymalizacja starterów:

• Kontrola temperatury stapiania z primerów matrycą (wzór prosty + wzory bardziej złożone dostępne on-line w postaci kalkulatorów temperatury)

• Kontrola dimeryzacji primerów i tworzenia struktur II-rzędowych typu „spinki” (obliczanie energii parowania zasad między homo- i heterodimerami oraz w spinkach)

http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

ETAP 5 – Zaplanowanie reakcji PCR

• dobór odpowiedniej polimerazy w zależności od długości oczekiwanego produktu

• dobór zestawu /producenta polimerazy

• zaplanowanie programu PCR, długości trwania poszczególnych cykli zgodnie z wytycznym producenta

• obliczenie ilości reagentów potrzebnych do reakcji

• Założenia:

- stężenie matrycy - 0,05mg/ml

stężenie mieszaniny dNTP - 10mM

standardowe stężenie starterów w głównym stoku - 100μM

ETAP 6 – Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego osobno dla badanego genu i plazmidu

• Sprawdzenie, w jakim wspólnym buforze oba enzymy mają 100% aktywność DoubleDigest

• 1 µl (10x stężonego*) buforu na 10 µl reakcji

• *np. 2XTango mówi, że końcowe stężenie ma być 2-krotne

• 1000 ng/ µl plazmidu i tyle samo wstawki

ETAP 7 – Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia sekwencji badanego genu z plazmidem

• Dobór odpowiedniego stosunku ilości plazmidu do insertu

• Ustalenie ilości jednostek ligazy na reakcję w zależności od rodzaju końców pozostawionych po trawieniu restrykcyjnym