Sprawozdanie z ćwiczeń z przedmiotu agrobiotechnologie

Temat:

Mikrorozmnażanie in vitro drogą organogenezy i embriogenezy somatycznej. Wpływ regulatorów wzrostu na indukcję pędów przybyszowych, kalusa i proces organogenezy.

Wykonawcy:

Irena Waśkiewicz

Karolina Walinowicz

1. Cel zadania

Określenie wpływu regulatorów wzrostu na indukcje pędów przybyszowych, kalusa i proces organogenezy.

1. Wprowadzenie merytoryczne

Technika mikrorozmnażania (rozmnażania klonalnego) pozwala rozmnożyć w warunkach in vitro materiał roślinny z niewielkich fragmentów roślin, tkanek lub pojedynczych komórek i otrzymać tym sposobem dużą ilość sadzonek w krótkim czasie. Jako eksplantaty pierwotne wykorzystywane są tu przede wszystkim tkanki merystema tyczne, składające się z młodych, zdrowych, szybko dzielących się komórek. Tkanki te pozbawione są patogenów grzybowych i wirusowych, stąd dają początek zdrowym roślinom.

Embriogeneza somatyczna- tworzenie w warunkach In vitro zarodków somatycznych z komórek somatycznych. Znaczenie:

• Pozwala na uniezależnienie produkcji cennego materiału siewnego od czynników klimatycznych.

• Umożliwia przyspieszenie tworzenia nasion u roślin charakteryzujących się długim cyklem ich produkcji.

• Somatyczne zarodki mogą być bezpośrednio lub po wysuszeniu (i, lub otoczkowaniu) wykorzystywane jako tzw. sztuczne nasiona.

Cechy charakterystyczne embriogenezy somatycznej:

Zarodki somatyczne rozwijają się w warunkach In vitro bezpośrednio lub pośrednio z komórek eksplantatu pierwotnego. Globularne stadia zarodków somatycznych są większe niż zygotycznych. Merystem wierzchołkowy zarodków somatycznych jest słabo rozwinięty. Zarodki somatyczne wytwarzają dwa i więcej liścieni i często są one drobne. W rozwoju zarodka somatycznego nie ma procesu tworzenia się bielma. Zarodki somatyczne nie są okryte okrywą nasienną i stąd nie ma stadium liścieniowego w postaci „laski”. Zarodki somatyczne naturalnie nie przechodzą procesu uśpienia, kiełkują przedwcześnie.

Bezpośrednia embriogeneza somatyczna

Zarodki somatyczne formują się bezpośrednio tylko z tych komórek roślinnych, które są kompetentne już w momencie izolowania z rośliny macierzystej, czyli z pro embriogenicznie zdeterminowanych komórek PEDCs- komórek predysponowanych do różnicowania zarodków. PEDCs charakteryzuje się małymi rozmiarami, gęstą cytoplazmą, małymi wakuolami, dużym jądrem z wyraźnymi jąderkami i plastydami. Cechuje się dużą aktywnością podziałową i metaboliczną. Po przeniesieniu PEDCs następuje wyzwolenie naturalnej zdolności embriogennych komórek i rozpoczynają się intensywne podziały komórkowe. Bodźcem wyzwalającym proces embriogenezy bezpośredniej jest głównie egzogenna auksyna.

Pośrednia embriogeneza somatyczna

Zarodki somatyczne formują się z komórek kalusa, który powstaje na ekasplantatach roślinnych. Żywe komórki ekspalantatu pod wpływem czynników kultury ulegają odróżnicowaniu (dedyferencjacji) do stanu merystema tycznego. Następnie w wyniku podziałów wytwarzają kalus embriogenny. W obrębie kalusa powstają indukowane embriogenicznie zdeterminowane komórki IEDCs. IEDCs – komórki małe gęsta cytoplazma, słabe wakuole, duże jądro z wyraźnymi jąderkami i plastydy zawierające ziarnka skrobi. Komórki te po kolejnych podziałach nie ulegają rozdzielaniu i w efekcie doprowadzają do powstawania PEMu, a z niej do formowania jednego lub kilku zarodków.

Prawidłowy przebieg embriogenezy somatycznej w warunkach In vitro zależy od spełnienia dwóch warunków.

Do zapoczątkowania procesu niezbędna jest w pożywce obecność auksyny lub substancji auksynopochodej , która stymuluje podziały i wzrost komórek oraz powoduje rozdzielenie się komórek potomnych po podziale. Zwiększa się zagęszczenie komórek. Dochodzi do powstania IEDCs, a następnie PEMu.

Z chwilą rozpoczęcia embriogenezy koniczne jest obniżenie stężenia lub całkowitego usunięcia auksyny z pożywki gdy hamuje rozwój embriogenezy ponieważ z chwilą powstania PEMu następuje zmiana reakcji komórek na auksynę. Auksyna powoduje zwiększenie kwasowości ściany komórkowej, przez co staje się bardziej rozciągliwa wskutek czego komórka może rosnąc (kwasowa teoria wzrostu).

Auksyna hamuje wnikanie jonów wapnia i komórek PEMu co ogranicza prawidłową ekspresją genów i tworzenie struktur biegunowych. .

Organogeneza

Powstawanie przybyszowych struktur jednobiegunowych, tj. pędów, korzeni, kwiatów. W zależności od eksplantau zawiązki nowych organów powstają z różnych warstw komórek np. w ekspalnatatach łodygowych lub liściowych z epidermy lub warstw subepidermalnych. W ekspalantatach korzeniowych merystemów wtórnych z kory pierwotnej.

Organogeneza bezpośrednia

Tworzenie zawiązków jednobiegunowych organów przybyszowych bezpośrednio z komórek pobranych z rośliny dawcy. Kompetentnymi do organogenezy bezpośredniej w obrębie eksplantatu mogą być: pojedyncze komórki, niewielkie skupiska komórek. Organogeneza bezpośredni z pojedynczych komórek kompetentnych- powstające po sobie podziały doprowadzają do wytworzenia grupy kilku lub kilkunastu komórek merystema tycznych, tworzących jeden związek organu (inicjał).

Organogeneza bezpośrednia- skupisko komórek kompetentnych- utworzone przez dzielące się komórki jednego zawiązka powstanie tych zawiązków ile było komórek kompetentnych.

Organogeneza pośrednia

Proces formowania de Novo zawiązków organów przybyszowych z komórek kalusa powstającego wtórnie na ekspalntacie roślinnym. Żywe komórki wyizolowane z rośliny dawcy a nie mające kompetencji morfogenetycznych pod wpływem czynników kultury In vitro podlegają odróżnicowaniu (dedyferancjacji) do stanu merystema tycznego. Komórki te poprzez szybkie i wielokrotne podziały doprowadzają do wytwarzania klusa. W niektórych jego komórkach dochodzi do indukcji kompetencji i w wyniku zmiany ekspresji określonych genów zaczyna się proces powtórnego różnicowania się (redyferencji) w wybranym kierunku.

1. Opis przebiegu doświadczenia, zestawienie i opis przeprowadzonych obserwacji, wnioski końcowe.

Matodyka:

Założenie kultury kalusowej z krążków liściowych tytoniu Nicotiana tabacum) .

Ze sterylnej kultury tytoniu odizolowano pojedynce liście i na sterylnej płytce wycięto krążki liściowe przy użyciu sterylnego korkoboru. Krążki po 5 sztuk wyłożono na dwie płytki z pożywką do indukcji kalusa:

1. MS z dodatkiem kinetyny 0,1mg/l i NAA 0,1 mg/l.

2. MS z dodatkiem kinetyny 0,3 mg/l i NAA 0,1mg/l

3. MS- kontrola.

Płytki zaklejono para filmem i umieszczono na świetle i w ciemności w temperaturze 24 °C na dwa tygodnie.

Analiza wyników i opis przeprowadzonych obserwacji

	Światło	Ciemność
A
B
C

Opis wyników przeprowadzonej obserwacji:

Wnioski:

Założenie kultury kalusowej z ogonków liściowych tytoniu (NIcotiana tabakum)

Metodyka:

Ze sterylnej kultury tytoniu odizolowano pojedyncze liście i na sterylnej płytce odcięto ogonki liściowe przy użyciu sterylnego skalpela. Na pożywki wyłożono po 3 pocięte na drobne fragmenty ogonki liściowe (rozmieszczono je równomiernie). Użyto następujących pożywek do indukcji kalusa:

1. MS z dodatkiem kinetyny 0,1mg/l i NAA 0,1 mg/l

2. MS z dodatkiem kinetyny 0,3mg/l i NAA 0,1 mg/l

3. MS- kontrola

Następnie płytki zaklejono parafilmem i umieszczono na świetle iw ciemności w temperaturze 24°C na dwa tygodnie.

Analiza wyników i opis przeprowadzonych obserwacji

	Światło	Ciemność
A
B
C

Opis wyników przeprowadzonej obserwacji:

Wnioski: