Sprawozdanie nr 5

Temat: Wpływ inhibitorów i czynników fizycznych
na przebieg reakcji enzymatycznej.

Zadanie 1. Wpływ pH na aktywność inwertazy drożdży.

Wykonanie:
Przygotować 7 probówek. Do 6 probówek wprowadzić po 1 ml odpowiedniego buforu o pH 3; 4,7; 5; 7; 9 i 11. Następnie do każdej probówki dodać 1 ml 0,3M sacharozy oraz 1 ml inwertazy o optymalnym stężeniu. Przygotować także próbę kontrolną w 7-mej probówce zawierającą 1ml buforu o pH 4,7; 1ml 0,3M sacharozy i 1 ml wody zamiast enzymu. Po wymieszaniu wszystkich składników mieszaniny inkubacyjne zostawić na 30 minut. Po tym czasie zalkalizować próby paroma kroplami 1M roztworu NaOH (sprawdzić pH), a następnie we wszystkich mieszaninach wykonać próbę Benedicta. W tym celu do siedmiu czystych probówek dodać po 1 ml odczynnika Benedicta i do każdej z nich dodać 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej. Probówki umieścić na ok. 1-2 minuty we wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje:

pH	Siła enzymu
2,0	+
4,7	+++
5,0	++
7,0	+
9,0	-
11,0	-
Próbówka kontrolna	-

W probówce kontrolnej oraz w probówkach z buforem o pH 9,0 i 11,0 roztwór nie odbarwił się. W probówce z buforem o pH 2,0 i pH 7,0 roztwór odbarwił się lekko, natomiast w probówkach z buforami o pH 4,7 i 5,0 zmiana zabarwienia było silniejsza.

Wnioski:
Inwertaza rozkłada sacharozę na glukozę i fruktozę, czyli cukry redukujące, dlatego jej działania można wykryć próbą Benedicta. Aktywna jest w zakresie pH od 4 do 6, optimum to 4,7, dlatego też w probówce z buforem o pH 7 roztwór odbarwił się najsilniej, a w pozostałych, im bliżej granicy aktywności, tym odbarwienie było słabsze.

Zadanie 2. Wpływ temperatury na aktywność inwertazy drożdży.

Wykonanie:
Przygotować 6 probówek, a następnie do wszystkich dodać po 0,5 ml sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7 oraz do pięciu z nich 0,5 ml inwertazy drożdżowej o optymalnym stężeniu. Do szóstej probówki zamiast inwertazy dodać 0,5 ml wody. Próby umieścić na 30 minut w temperaturze: 4, 20, 37, 60, 100 , a próbę kontrolną w temperaturze . Po zakończeniu inkubacji zalkalizować próby paroma kroplami 1M roztworu NaOH (sprawdzić pH !), a następnie we wszystkich mieszaninach wykonać próbę Benedicta. W tym celu do sześciu czystych probówek dodać po 1 ml odczynnika Benedicta i do każdej z nich dodać 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej. Probówki umieścić na ok. 1-2 minuty we wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje:

W próbie kontrolnej oraz w probówce o temperaturze 100ﱞC roztwór nie odbarwił się(był niebieski).W reszcie probówkach nastąpiła lekka zmiana zabarwienia, a w probówce o temperaturze 20^˚C zmiana zabarwienia była najsilniejsza. Przy ok. 37˚C pojawia się zabarwienie czerwone.

Wnioski:

Możliwe jest, iż czas inkubacji był za krótki, jeżeli mamy za gęstą zawiesinę to czas ten musi być dłuższy. Inwertaza drożdżowa wykazuje aktywność w przedziale temperatur od 20 ⁰C do 60⁰C, przy czym w górnej granicy jest ona niższa. Swoja najwyższą wartość przyjmuje w temp. 37 ⁰C natomiast w temp. 4 ˚C i 100^˚C inwertaza nie wykazuje żadnej aktywności.

Zadanie 3. Wpływ promieniowania UV na aktywność inwertazy drożdży.

Wykonanie:
Na szkiełko zegarkowe wlać 6 ml inwertazy z drożdży i poddać ją naświetlaniu promieniami ultrafioletowymi. Po czasie naświetlania: 0 sek., 10 sek., 20 sek., 30 sek., 1 min., 2 min., 3 min., 4 min. pobierać do kolejnych probówek po 0,5 ml roztworu inwertazy i do wszystkich ośmiu prób dodać 0,5 ml roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7. Próby wymieszać i umieścić na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie zalkalizować próby paroma kroplami 1M roztworu NaOH. Następnie we wszystkich mieszaninach wykonać próbę Benedicta. W tym celu do ośmiu czystych probówek dodać po 1 ml odczynnika Benedicta i do każdej z nich dodać 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej. Probówki umieścić na ok. 1-2 minuty we wrzącej łaźni wodnej.

Obserwacje:

Czas	Stopień zabarwienia
0 s	+
10 s	++
20 s	+++
30 s	++
1 min	-
2 min	-
3 min	-
4 min	-
4 min 20 s	-

W probówkach o czasie naświetlania 0, 10, 20 i 30 sekund nastąpiło zabarwienie roztworu na pomarańczowo (intensywność zabarwienia podana jest w tabeli i określona ilością plusów, im więcej plusów tym zabarwienie było intensywniejsze). Natomiast w pozostałych probówkach nie doszło do zabarwienia.

Wnioski:
Aminokwasy aromatyczne występujące w białkach absorbują promieniowanie UV, co powoduje zaburzenia ich struktury. Czas naświetlania 0, 10, 20 i 30 sekund jest niewystarczający, aby zaburzyć strukturę białka, dlatego sacharoza pod wpływem inwertazy uległa rozkładowi na glukozę i fruktozę, co wykazała próba Benedicta. Dłuższy czas naświetlania powoduje już zniszczenie struktury białka, a tym samym niszczy enzym, dlatego nie nastąpił rozkład, potwierdziła to próba Benedicta, roztwory nie odbarwiły się.