METODY OZNACZANIA WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI

Skuteczność antybiotyku

• Aktywność wobec czynnika etiologicznego – cel badania mikrobiologicznego (częściowo również stwierdzenie, jakie stężenie powinien przybrać antybiotyk w ognisku zakażenia, aby był skuteczny)

• Stężenie w ognisku zakażenia – farmakokinetyka i farmakodynamika

Terapia

empiryczna	ustalenie najbardziej prawdopodobnego czynnika etiologicznego na podstawie danych epidemiologicznych i objawów klinicznych, a wybór antybiotyku aktywnego wobec przypuszczalnego czynnika etiologicznego po uwzględnieniu lokalnej sytuacji epidemiologicznej
celowana	wyboru antybiotyku dokonuje się spośród leków, które w wyniku badania mikrobiologicznego okazały się aktywne wobec wyizolowanego czynnika etiologicznego zakażenia (antybiogram). Wyboru należy dokonać w oparciu o pozostałe informacje, takie jak umiejscowienie zakażenia i związane z tym wymogi farmakokinetyczne, stan chorego itp.
sekwencyjna	oznacza podawanie tego samego leku najpierw pozajelitowo, a następnie drogą doustną. Pierwsza dawka doustna powinna być podana w szpitalu, przed wypisaniem chorego do domu dla oceny tolerancji i poprawy stanu klinicznego.
deeskalacyjna	metoda stosowana w najcięższych zakażeniach, polegająca na zastosowaniu w początkowej fazie leczenia antybiotyków o najszerszym spektrum (zazwyczaj terapia skojarzona), a po uzyskaniu wyników badań mikrobiologicznych, zmiana terapii na lek o węższym spektrum aktywny wobec wyizolowanego drobnoustroju (monoterapia).
pierwszego, drugiego rzutu	leczenie z wyboru, leczenie alternatywne

Kinetyka antybiotykowa

• Wyniki badań mikrobiologicznych z reguły polegają na określeniu, czy przyjęte jako graniczne stężenie leku hamuje wzrost drobnoustrojów – szczep wrażliwy.

Informacje o dawkowaniu leków

Wartości graniczne zostały tak zaproponowane w odniesieniu do odpowiednich typów zakażenia dawek leków, iż na wyniku badania mikrobiologicznego nie ma potrzeby umieszczania informacji o dawkowaniu leków. Decyzję o leczeniu podejmuje lekarz (dobór leku, dawkowanie, postać leku) biorąc pod uwagę stan kliniczny pacjenta i wyniki badań dodatkowych diagnostycznych.
W przypadkach, gdy jest to niezbędne do stosowania prawidłowo dobranej terapii zaleca się umieszczenie komentarzy w badaniu mikrobiologicznym dotyczących dawkowania leku, np.

1. Zakażenia inwazyjne – zaleca się stosowanie wysokich/maksymalnych dawek leków.

2. Aminoglikozydy – wartości stężeń granicznych amino glikozydów ustalono dla wysokiej dawki leków podawanej raz dziennie. Amino glikozydy stosuje się najczęściej w terapii skojarzonej z antybiotykami β-laktamowymi.

3. S. pneumoniae i aminopenicyliny - w zapaleniu płuc szczep o wartości MIC≤2mg/L wrażliwy przy zastosowaniu amoksycyliny doustnie w dawce 3x1g lub ampicyliny dożylnie 4x1g, a w zapaleniu płuc szczep o wartości MIC≤0,5mg/L dla penicyliny benzylowej wrażliwy przy zastosowaniu dawki 4x1,2g (4x2mln jm)

4. Enterobacteriaceae i cefuroksym – wartość graniczna odnosi się do dawki 3x1,5g wyłącznie wobec E.coli, P.mirabilis, Klebsiella spp.

Metody badania wrażliwości drobnoustrojów na chemioterapeutyki:
- fenotypowe
- biologii molekularnej
podlegają pełnej standaryzacji – zgodnie z zaleceniami:
CLSI (do 2005 roku znany jako NCCLS)
Europejskiej Komisji Testowania Wrażliwości Drobnoustrojów EUCAST
Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów KORLD

Do kontroli jakości oznaczania wrażliwości na wybrane antybiotyki stosuje się szczepy wzorcowe z kolekcji ATCC, MIKROBANK

Szczepy, które należy przesyłać do KORLD w celu potwierdzenia fenotypu oporności:

1.szczepy S. aureus oporne na wankomycynę - VRSA

2.szczepy S. ureus średniowrażliwe na wankomycynę o heterogennej ekspresji oporności - hVISA oraz średniowrażliwe na wankomycynę - VISA

3.szczepy S. aureus oporne na linezolid

4.szczepy S. aureus oporne na daptomycynę

5.szczepy S. aureus oporne na tigecyklinę

6.Enterococcus faecalis oporne na penicylinę lub na ampicylinę

7.enterokoki oporne na wankomycynę – VRE

8.enterokoki oporne na linezolid

9.enterokoki oporne na daptomycynę

10.enterokoki oporne na tigecyklineę

11.szczepy S. pyogenes oporne na penicylinę

12.szczepy S. pneumoniae oporne na wankomycynę

13.szczepy H. influenzaeo fenotypie BLNAR i BLPACR

14.szczepy H. influenzae oporne na fluorochinolony

15.szczepy H. influenzae oporne na cefalosporyny III-generacji

16.szczepy N. meningitidis oporne na penicylinę

17.szczepy N. meningitidis oporne na rifampicynę

18.szczepy N. meningitidis oporne na ciprofloksacynę

19.szczepy N. meningitidis oporne na cefalosporyny III generacji

20.szczepy różnych gatunków wytwarzające nabyte β-laktamazy MBL

21.szczepy różnych gatunków podejrzane o wytwarzanie β-laktamazy KPC

22.szczepy różnych gatunków oporne na tigecyklinę

23.wszystkie szczepy, które po ponownym sprawdzeniu, wzbudzają podejrzenie posiadania rzadkiego lub niespotykanego dotychczas mechanizmu oporności

Metody te różnią się dla poszczególnych grup
Różnice dotyczą składu podłoży, inokulum, warunków i czasu inkubacji oraz interpretacji wyników. Najczęściej wykorzystywanym podłożem jest agar Mueller-Hintona.

Skala McFarlanda

• Standardy zawierają chlorek baru i kwas siarkowy zmieszane razem, co powoduje zmętnienie roztworu poprzez powstanie osadu siarczanu baru

• Np. zmętnienie odpowiadające 0,5 w skali McFerlanda powstaje poprzec zmieszanie 0,05ml-1,175% BaCl₂ ● 2H₂O z 9,95ml-1% H₂SO₄

Metody jakościowe

Metoda dyfuzyjna z użyciem krążków bibułowych nasączonych chemioterapeutykami w stężeniach jakie one osiągają (…)

Na wielkość strefy zahamowania wzrostu w metodzie krążkowo-dyfuzyjnej wpływa:

• Gęstość inoculum (zawiesina o gęstości 0,5 w skali McFerlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie 1-2x10⁸ c.f.u./ml)

• Czas nałożenia krążków

• Temperatura inkubacji

• Czas inkubacji

• Rozmiar płytek, grubość warstwy podłoża agarowego i rozmieszczenie krążków – na płytkach o średnicy 9-10cm umieszcza się nie więcej nić 5 krążków

• Stężenie antybiotyków w krążkach, ich odpowiednie przechowywanie

• Skład podłoża

Metody ilościowe

- Metody rozcieńczenia na podłożu stałym lub płynnym określające najmniejsze stężenie chemioterapeutyku hamujące wzrost bakterii (MIC w mg/l)

- Metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu płynnym umożliwia także oznaczenie wartości najmniejszego stężenia bakteriobójczego (MBC).

- Metoda dyfuzyjna przy użyciu pasków bibułowych nasyconych antybiotykiem w gradiencie stężeń (E-test)

- Analizatory mikrobiologiczne („kombajny”)

Inoculum – liczba komórek bakteryjnych w podłożu płynnym, wyrażona jako liczba jednostek tworzących kolonię na mililitr (CFU/ml). Może być również określane jako zmętnienie lub gęstość optyczna zawiesiny bakteryjnej.

MIC określa najmniejsze stężenie lek, wyrażone w mg/l, oznaczone w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum w określonym czasie.
(pierwsza probówka, gdzie nie obserwuje się wzrostu bakterii)

MBC określa minimalne stężenie leku, wyrażone w mg/l, oznaczone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych, przy określanej gęstości inokulum i w określonym czasie.
(pierwsza płytka bez wzrostu)

! ! ! (MBC/MIC)≥32 – brak efektu terapeutycznego

Określenie wielkości strefy zahamowania wzrostu (mm) i wartości MIC (mg/l) pozwala na uzyskanie stężeń granicznych umożliwiających zakwalifikowanie badanego szczepu do jednej z trzech kategorii:

• Wrażliwy – oznacza brak mechanizmów oporności i możliwość zastosowania dawek leku rutynowo stosowanych w leczeniu

• Średnio wrażliwy – oznacza, iż możliwe jest zastosowanie leku, ale w odpowiednio zwiększonej dawce lub z większą częstotliwością względnie bez konieczności zwiększania dawki w przypadku zakażenia toczącego się w miejscu, w którym lek osiąga szczególnie wysokie stężenie (np. mocz i leczenie ZUM)

• Oporny – wyklucza możliwość zastosowania leku

Zakres badań

• Antybiogram podstawowy – zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu.

• Antybiogram podstawowy dla szczepów z moczu – obejmuje antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu wobec szczepów izolowanych z zakażeń układu moczowego.

• Antybiogram rozszerzony – zawiera on rozszerzoną listę antybiotyków stosowanych wobec drobnoustrojów (również dla szczepów z zakażeń u.moczowego) wieloopornych i/lub izolowanych z ciężkich zakażeń.

Oporność naturalna (własna, dziedziczna)
- stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny drobnoustrojów. Przeciwbakteryjne działanie leków jest niewystarczające lub lekooporność drobnoustroju jest tak powszechna, że lek uznawany za klinicznie NIESKUTECZNY i zbędnym jest oznaczanie jego wrażliwości.

Naturalna oporność wynika z:

1. Braku w komórce bakteryjnej celu („receptora”) dla danego antybiotyku lub niskiego powinowactwa do niego
   (antybiotyki β- laktamowe – Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae;
   cefalosporyny i penicyliny izoksazolilowe – Enterococcus spp.)

2. Braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku przez ścianę komórkową
   (makrolity, glikopeptydy – Enterobacteriaceae;
   aminogklikozydy - Enterococcus spp., Streptococcus spp.)

3. Wytwarzaniem enzymu inaktywującego antybiotyk
   (karbapenemy –karbapenemaza zależna od jonów Zn u Stenotrophomonas maltophilia)

Oporność krzyżowa
- oznacza niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej (np. antybiotyki β-laktamowe, amino glikozydy, makrolity) lub – niekiedy – niespokrewnionej grupy chemicznej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie (np. oporność na makrolity i linkozamidy). Mechanizmy oporności wynikające z braku przepuszczalności błony komórkowej lub aktywnego wypompowania leku z komórki mogą powodować oporność na więcej niż jedną grupę chemiczną; zjawisko to jest niekiedy określane jako oporność skojarzona.

Oporność in vitro nie gwarantuje skuteczności leczenia.

Brak efektu terapeutycznego może być spowodowany:

1. Trudno dostępną dla leku lokalizacją zakażenia (otorbione ropnie)

2. Stacjonarna faza rozwoju wzrostu bakterii w miejscu zakażenia (np. penicylina działa wyłącznie na bakterie w logarytmicznej fazie wzrostu)

3. Działaniem osłonowym bakterii towarzyszących głównie czynnikowi etiologicznemu zakażenia (np. przez wytwarzanie enzymów zewnątrzkomórkowych inaktywujących stosowany lek, np. paciorkowce + gronkowce wytwarzające penicylinazę)

4. Obecnością w surowice lub innych płynach ustrojowych substancji interferujących z zastosowanym antybiotykiem i obniżającym jego skuteczność

5. Brakiem pełnego rozpoznania etiologii (zakażenia mieszane)

6. Powstaniem L form bakterii (bez peptydoglikanu) po stosowaniu leków działających na syntezę bakteryjnej ściany komórkowej

7. Selekcją w trakcie terapii wariantów opornych (najczęściej, gdy pojedyncza mutacja warunkuje oporność – np. monoterapia kwasem nalidyksowym lub fosfomycyną)