WYKŁAD nr 3

• metody badania DNA:

• reakcja łańcuchowej polimerazy (technika PCR)

• odkrycie enzymów restrykcyjnych

1. izolacja (ekstrakcja) materiału DNA

2. określenie ilości i jakości ( czystości) DNA

3. namnożenie wybranego fragmentu genu (amplifikacja)

4. detekcja (wykrycie) produktów amplifikacji – metody żelowe (istnieją dwa rodzaje żelów: agarowy i poliakrylamidowy) – elektroforeza

5. wykrywanie mutacji

• źródła DNA:

• krew pełna

• złuszczone komórki błony śluzowej jamy ustnej

• hodowla fibroblastów skóry

• cebulka włosowa

• trofoblast

• komórka płynu owodniowego

• 1/2 blastomery pobrane z 8-komórkowego zarodka (badania preimplantacyjne)

• fragment dowolnej tkanki

• krew do badań:

• min. 1 ml krwi pobranej w sposób jałowy

• antykoagulant – EDTA (stężenie końcowe 0,1%) lub cytrynian sodu

• nie należy używać heparyny, bo hamuje aktywność polimerazy DNA

• izolacja DNA – najlepiej w dniu pobrania

• przechowywanie: od -20^OC do -80^OC; krócej niż 48 godzin

• **szpik kostny – min 1-5 ml; przechowywanie w 4^OC do 24 godzin

• guzy:

• natychmiastowa homogenizacja i izolacja

• pobranie do sterylnych probówek i zamrożenie (od razu) w temperaturze od -20^OC do -80^OC

• umieszczenie świeżo pobranych tkanek w buforze do lizy i zamrożenie

• oznaczanie czystości DNA metodą spektrofotometryczną:

• dla białek λmax = 280nm (zanieczyszczenie DNA to obecność białek)

• stosunek λ260/λ280 powinien wynosić dla czystego DNA 1,8-2,0 (wartości >2,0 oznaczają zanieczyszczenie RNA; wartości <1,8 oznaczają zanieczyszczenie białkiem)

• metoda PCR to enzymatyczna amplifikacja wybranych sekwencji DNA; w ciągu 2-3 godzin umożliwia powielenie DNA

• aby przeprowadzić metodę PCR:

• musimy znać sekwencje nukleotydów obu końców DNA

• musimy dysponować odpowiednią polimerazą DNA, zestawem odczynników oraz urządzeniem do powielania (tzw. thermocycler)

• musimy posiadać odpowiednie substraty: matrycowy DNA (matrycę DNA otrzymuje sięprzez denaturację termiczną dwuniciowego DNA), polimerazę DNA, startery, DTP, jony Mg2+, bufor reakcji, wodę

• polimerazy DNA:

• termolabilna polimeraza E. coli

• termostabilna polimeraza Taq z bakterii Thermopilus aquaticus

• etapy reakcji PCR:

• termiczna denaturacja dwuniciowego DNA

• hybrydyzacja, czyli łączenie się starterów z matrycą

• elongacja łańcucha DNA

• do reakcji PCR wystarczają pikogramowe ilości DNA

• istnieje możliwość użycia zdegradowanego DNA pod warunkiem, że amplifikowana sekwencja nie jest zdegradowana

• ilość DNA uzyskiwana w PCR to 0,2-2 mg; wystarcza do:

• uwidocznienia DNA w żelu agarowym

• analizy restrykcyjnej

• sekwencjonowania

• elektroforeza – rozdzielenie mieszaniny związków na jednorodne frakcje przez wymuszenie ich wędrówki w polu elektrycznym

• ruchliwość cząsteczki w żelu:

• zależy od jej kształtu

• jest wprost proporcjonalna do ładunku elektrycznego cząsteczki

• jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki

• polimorfizm genetyczny – występowanie dwóch lub więcej alleli danego genu z częstością większą niż oczekiwana; wynikająca z ogólnej częstości mutacji w obrębie mutacji (najrzadszy wariant alleli występuje częściej niż 1%)

• przesiewowe metody wykrywania polimorfizmu:

• SSCP – polimorfizm konformacji jednoniciowego DNA

• RFLP – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

• SSCP – opiera się na analizie zmiany szybkości migracji w żelu jednoniciowych DNA (dwuniciowy DNA poddajemy denaturacji i nanosimy na żel poliakrylamidowy):

• cząsteczki dwuniciowe poruszają się szybciej niż jednoniciowe (jednoniciowe tworzą pętle itp., które utrudniają im przeciskanie się w żelu)

• w wyniku wewnątrzcząsteczkowego parowania zasad DNA (ssDNA) zgina się w trójwymiarową strukturę

• RFLP – polega na trawieniu DNA endonukleazami restrykcyjnymi, które rozpoznają określone sekwencje nukleotydów i przecinają DNA w obrębie tych sekwencji – każde odstępstwo od wzorcowego wzoru (:D) świadczy o mutacji

• DNA fingerprinting – daktyloskopia genetyczna – różnice w liczbie i lokalizacji miejsc przecinanych przez enzymy restrykcyjne są wynikiem polimorfizmu DNA

• mikromacierze DNA:

• „chip” DNA – silikonowa płytka zawierająca wiele sond oligonukleotydowych

• badane DNA znakuje się fluorescencyjnie i nanosi na powierzchnię płytki

• sygnał fluorescencyjny – sonda hybrydyzowana z badanym DNA

• możliwość oznaczenia wielu SNP w 1 eksperymencie