lista 4 SYNTEZA I SPLICING RNA
1. Transkrypcja u prokariota, E.Coli, polimeraza RNA - holoenzym(budowa i funkcje podjednostek !!!); trzy etapy:
a) inicjacja, (sekwencje promotorowe !!!)
b) elongacja,
c) terminacja (struktura spinki, białko ρ !!!)
2. Transkrypcja u eukariota: trzy polimerazy RNA, ścisła regulacja: czynniki transkrypcyjne -> aktywność promotorów, sekwencje wzmacniające (enhancers) stymulujące inicjację transkrypcji, pierwotne transkrypty prekursorowe -> pre- mRNA ulegają modyfikacjom, specyf. struktura na końcu 5’ oraz do końca 3’ ogon poli(A). SPLICING>katalizowany przez spliceosom zbud. z rybonukleoprotein -> snRNP - kompleks białek i snRNA (niskocząsteczkowe jądrowe RNA)
Trzy rodzaje splicingu!!! 1. Autokatalityczny; 2. przeprowadzany przez spliceosom; 3. ?
1. TRANSKRYPCJA U PROKARIOTA (E.COLI)
Synteza RNA prowadzona jest przez holoenzym - polimerazę RNA.
ELEMENTY DZIAŁAJĄCE W UKŁADZIE CIS- elementy znajdujące się na tej samej cząsteczce DNA; na tym samym łańcuchu, np. miejsca promotorowe.
Holoenzym oddziałuje z białkami aktywującymi i wpływającymi negatywnie na syntezę - czynniki transkrypcyjne ! (znacznie wazniejsze u eukariota) - CZYNNIKI DZIAŁAJĄCE W UKŁADZIE TRANS (ponieważ nie znajdują się na łańcuchu DNA, tylko są odrębnymi cząsteczkami)
BUDOWA HOLOENZYMU E.COLI - POLIMERAZA RNA
α2ββ’σ podjednostki
σ sigma70 - odszukuje miejsca promotorowe, pomaga zainicjować syntezę RNA, oddysocjowuje od enzymu!
β - wiąze NTP i katalizuje powstawanie wiązań
β’ - wiąże matrycę DNA
α - wiąże białka regulujące
α2ββ’ - rdzeń enzymu bez sigmy, zawiera centrum katalityczne
centrum katalityczne ma dwa jony metalu, jeden stale związany, drugi pojawia się z trifosforanem nukleozydu, opuszcza z pirofosforanem, biorą w tym udział 3 konserwatywne reszty kwasu asparaginowego;
SEKWENCJE PROMOTOROWE
od strony 5’ miejsca startu transkrypcji - sekwencje -10 i -35,
5’ ---- TTGACA --------TATAAT ----- +1 miejsce startu
-35 -10
numeracja dotyczy nici kodującej. sekwencja matrycowej nici DNA jest komplementarna do nici transkryptu RNA, kodująca nić DNA ma taką samą sekwencję jak transkrypt RNA (zamiast T-U), nić kodująca - nić sensowna (+) , nić matrycowa - nić antysensowna (-).
INICJACJA TRANSKRYPCJI
podj σ - oddziałuje bezpośrednio z miejscami promotorowymi -35 i -10; polimeraza przesuwa się wdłuż DNA szukając miejsc promotorowych, sigma opuszcza holoenzym, gdy nowy łańcuch ma 9-10 nukleotydów, robiąca to podjednostka sigma u E.Coli to sigma70, kiedy temperatura rosnie dziala sigma35, która rozpoznaje promotory szoku cieplnego, w przypadku braku azotu dziala sigma54; wtedy sekwencje -10 są nieco inne niż standardowe.
Trzeba rozpleść DNA, przejście od kompleksu promotorowego zamkniętego (DNA w formie podwójnej helisy) do kompleksu promotorowego otwartego (rozpleciony segment DNA) jest bardzo istotne, Każda związana cząsteczka polimerazy RNA rozplata segment DNA o długości 17 pz, co odpowiada 1,6 skrętu helisy B-DNA. Ujemne superskręcenia wzrastają proporcjonalnie do liczby czast. polimerazy RNA.
Łańcuchy RNA syntetyzowane de novo, kierunek 5’->3’, nie wymagają startera, ale zazwyczaj koniec 5’ nowego łancucha RNA jest bardzo charakterystyczny, zaczyna się od pppG lub pppA.
ELONGACJA
utrata sigmy po utworzeniu kilku wiązań fosfodiestrowych, rdzeń enzymu silnie wiąże się z matrycą; powstaje bąbel transkrypcyjny, rozpleciony odcinek DNA o dł. 17 pz; 800 nukleotydów na sekunde; tworzy się hybryd RNA-DNA, grupa 3’-OH nici RNA na hybrydzie RNA-DNA jest tak umiejscowiona, że atakuje atom fosforu alfa przybywającego NTP (trifosforanu nukleozydu? xD)
TERMINACJA
struktura spinki - palindromowy rejon bogaty w pary G-C , z którym jest fragment bogaty w A-T, rejony komplementarne, zaraz za tym jest sekwencja 4 lub wiecej reszt U, transkrypt oddysocjowuje od matrycy, a następnie od enzymu, nić matrycowa łączy się z komplementarną i tworzy regularną helisę zamykając bąbel transkrypcyjny.
białko rho - matryca zawiera 3 miejsca wrażliwe na rho, przed terminacją gdy brak rho, wtedy tworzą się cząsteczki 10S, 13S, 17S, bez rho jest 23S, rho wykrywa dodatkowe sygnały terminacji, rho hydrolizuje ATP w obecności jednoniciowego RNA (ale nie w obecności DNA lub dwuniciowego RNA!); rho jest podobne strukturalnie do syntazy ATP; wiąze jednoniciowy RNA, działanie rho jest uzależnione od sekwencji bogatych w cytozynę, a ubogich w guaninę.
Wspólną cechą terminacji zależnej od białek i niezaleznej jest to , że w obu przypadkach aktywne sygnały umożliwiające przerwanie tranksrypcji tkwią w syntetyzowanym łańcuchu RNA, a nie w matrycy DNA.
ANTYBIOTYKI
ryfampicyna - hamuje inicjację syntezy RNA, blokuje kanał którym powinna sie przesuwac hybryda RNA-DNA, nie wstrzymuje elongacji łancucha którego synteza się juz zaczela; stosowana w leczeniu gruźlicy;
aktynomycyna D - wiąże się silnie do dwuniciowego DNA, co uniemożliwia wykorzystanie go jako matrycy; (nie wiąże się do niczego innego! tylko dDNA); interkalacja - pierścien fenoksazonowy tego antybiotyku wślizguje się między pary zasad DNA; w małych stężeniach hamuje transkrypcję bez wpływu na replikację DNA i syntezę białka; stosowana jako specyficznny inhibitor u eukariota i prokariota; zdolnośc do blokowania wzrostu szybko dzieląceych się komórek - w leczeniu niektórych nowotworów.
MINIMODYFIKACJE potranskrypcyjne u prokariota:
- cząsteczki mRNA podlegają niewielkiej modyfikacji lub wcale;
- tRNA i rRNA wytwarzane są przez rozcinanie i inne modyf. łańcuchów RNA; nukleazy specyficzne rozcinają te łańcuchy, np rybonukleaza P u E.Coli tworzy poprawne końce 5’ wszystkich tRNA; rybonukleaza III wycina prekursory 5S, 16S, 23S rRNA rozcinając RNA w rejonach spinek do włosów;
- drugi rodzaj dojrzewania: dodawnie nukleotydów do końców niektórych łańcuchów RNA; np. sekwencja CCA do tRNA (katalizowane przez enzym niezależny od matrycy DNA)
- modyfikacje zasad i reszt rybozy w rRNA; nietypowe zasady sa we wszystkich tRNA;(np. urydylan -> pseudourydylan; rybotymidylan) u prokariota niektóre zasady w rRNA ulegają metylacji.
2. TRANSKRYPCJA U EUKARIOTA
Tu sprawa wydaje się nieco bardziej skomplikowana x D
1. u eukariota transkrypcja i translacja rozdzielona w czasie i przestrzeni; transkrypcja w jądrze otoczonym błoną kom. translacja w cytoplazmie; u prokariota zaraz po utworzeniu mRNA zachodzi translacja;
2.epickie mechanizmy regulacji;duzo sekwencji promotorowych; sekwencje regulujace moga byc daleko od miejsca startu transkrypcji, np. sekwencje wzmacniające
3.dojrzewanie RNA; dojrzewanie pierwotnego transkryptu tylko u eukariota; splicing
TRZY RODZAJE POLIMERAZ RNA i PROMOTORY
polimeraza RNA I - w jąderku; transkrybuje rRNA: 18S, 5,8S, 28S, niewrażliwa na alfa-amanitynę; sekwencje promotorowe; rybosomowy element inicjatorowy - rInr; od 150-200 nukleotydów powyżej startu transkrypcji znajduje się element UPE (upstream promotor element).
28S ------- UPE-----rInr----------18S ----------5,8S-28S
polimeraza RNA II - w nukleoplazmie, prekursory mRNA oraz snRNA, bardzo wrażliwa na alfa-amanitynę, ma unikatową domenę CTD na karboksylowym końcu (wielokrotnie powtórzony motyw sekwencyjny YSPTSPS-aktywnośc regulowana przez fosforylację reszt serynowych i treoninowych w tym powtórzeniu); tylko u eukariota transkrypcja zależy od sekwencji wzmacniających (enhancers) które mogą być położone bardzo daleko (nawet dalej niz 1kz) od poczatku stranskrypcji;
sekwencja wzmacniająca -----//------kaseta TATA----Inr------------- lub
sekwencja wzmacniająca ----//-------Inr --------DPE------------------- (Inr element inicjatorowy. DPE element ----------------------------------------------|--promotor--------------|-----------promotorowy poniżej miejsca transkrypcji)
Najważniejszy element działajcy w cis - kaseta TATA; między nukleotyderm -30 a -100. Przypomina prokariotyczną sekwencję -10 (TATAAT); mutacja zmienia aktywność promotorową; często występuje z elementem inicjatorowym Inr pomiędzy -3 i +5 - wyznacza miejsce startu transkrypcji; wzmacnia aktywność transkrypcyjną promotora; trzeci element - rdzenia promotora położony poniżej(DPE) razem z Inr, ale bez TATA występuje; między nukleotydami +28 i +32.
Promotory genów eukariotycznych kodujących pre-mRNA zawierają również kasetę CAAT tudzież kasetę GC; między -40 i -150; ich położenie jest zmienne w przeciwności do -35 rejonu u prokariota który jest stały; ponadto CAAT i GC działa jak jest na nici matrycowej, a u prokariota rejon -35 musi byc na nici kodującej; sekwencje -10 i -35 to miejsca wiązania polimerazy RNA (a wlasciwie jej podjednostki sigma), a kasety TATA, CAAT, GC oraz inne elementy cis nie są bezpośrednio rozpoznawane przez polimerazę RNA II, a przez dodatkowe białka - czynniki transkrypcyjne. ( !!! o tym niżej jes !!!) mialo byc ale nie ma x D
polimeraza RNA III - tRNA i 5S rRNA; nukleoplazma; wrażliwa na duże stężenie alfa-amanityny; polimerazy RNA III leżą najczęściej w obrębie sekwencji kodującego; poniżej miejsca startu transkrypcji; są dwa typy promotorów (wewnątrzgenowe); są dwa typy jak widać na dole: dwa bloki zachowawcze; tRNA 11 nukleotydowe sekw. A i B; znajdujace się około 15 nukleotydów z każdej strony genu
typ I: 5S rRNA typ II : tRNA
----blok A ---- blok C----- ---blok A -- // ---- blok B
ZADANKA:
Tu zróbmy se przykładowe zadanko z listy 4 w celu utrwalenia;
Sekwencja segmentu dupleksu DNA;
5’ - ATCGCTTGTTCGGA-3’
3’ - TAGCGAACAAGCCT-5’
Gdy słuzy jako matryca dla polimerazy RNA daje początek segmentowi RNA o sekwencji:
5’ - UCCGAACAAGCGAU- 3’
Najpierw zapiszmy se komplementarną sekwencję do nici transkryptu RNA (będzie ona matrycową nicią)
5’-UCCGAACAAGCGAU-3’
3’-AGGCTTGTTCGCTA-5’
Odwracamy kolejność od 5’-3’ -> 5’ - ATCGCTTGTTCGGA - 3’ i widzimy, że jest to nić górna, czyli będzie to nić matrycowa, komplementarna do transkryptu RNA (nic antysensowna (-))
Nić kodująca, sensowna to będzie ta poniżej, ona ma taką samą sekwencję jak transkrypt RNA.
3’ - TAGCGAACAAGCCT- 5’ (jak se odwrócimy tego transkrypta)
3’ - UAGCGAACAAGCCU- 5’ (i jest epicko)
Zadanie 1 z książki strona 859.
1. Dla następującej sekwencji fragmentu mRNA przedstaw sekwencję nici kodującej i matrycowej DNA:
5’ - AUGGGGAACAGCAAGAGUGGGGCCCUGUCCAAGGAG-3’
robie se komplementarna i bede ja odwracac i bedzie to matrycowa:
3’ - TACCCCTTGTCGTTCTCACCCCGGGACAGGTTCCTC-5’
odwracam:
5’ - CTCCTTGGACAGGGCCCCACTCTTGCTGTTCCCCAT-3’ - NIĆ MATRYCOWA
3’ - GAGGAACCTGTCCCGGGGTGAGAACGACAAGGGGTA-5’ - NIĆ KODUJĄCA
dobrze jes ale oni w odpowiedziach podają nić kodującą od 5’ - 3’ ,a matrycową od 3’-5’ , nie wiem czy to ma jakieś duże znaczenie?