GENETYKA 10 PAŹDZIRNIKA 2009
WYKŁADY 2
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA CHORÓW GENETYCZNYCH
Pozyskiwanie DNA do celów diagnostycznych:
Izolacja DNA- wysoka wydajność i czystość dna
Analiza DNA
Marniał do izolacji DNA
Pełna krew obwodowa 2-3 ml.
Kom. płynu owodniowego (fibroblasty płodu)
Cebulki włosowe
Plamy krwi i nasienia
Przechowywanie materiału biologicznego
krótkie przechowywanie temp +4 stopnie
dłuższe przechowywanie, zamrożone w - 10 st.
materiał suchy temp. pokojowa, chronić przed wilgocią.
Etapy izolacji DNA:
Rozdrobnienie tkanki stałej, lizo erytrocytów i leukocytów
denaturacja i hydroliza białek- trawienie proteinazą K
usunięcie białek i innych zanieczyszczeń - ekstrakcja fenolem
zagęszczenie DNA- precypitacja
wytrącanie DNA z fazy wodnej 96% etanolem lub izopropanolem
Rozpuszczenie DNA
Izolacja RNA- podobny schemat jak w DNA, ale trzeba zapewnić specjalne warunki, zabezpieczenia RNA. W tym celu wprowadza się inhibitory, stosuje sie metodę dezintegrujące komórki i inaktywujące RNA
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)- enzymatyczna amplifikacja in vitro fragmentu genomowego DNA o długości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad
startery- jednoniciowe, oligonukleotydy ok 20 zasad.
Syntetyzowanie chemicznie....
Amplifikacja DNA w reakcji PCR odbywa sie przy udziale termo stabilnej polimerazy DNA wyizolowanej z termofilnych bakterii
- reakcja PCR prowadzona jest w cyklach powtarzających sie 20-40 razy
- wszystkie cykle składają sie z 3 etapów, z których każdy zachodzi w innej temperaturze i trwa ok..
- reakcja w probówce umieszczonej w bloku …., który umożliwia szybką precyzyjną zmianę temperatury, właściwą dla poszczególnych etapów procesu PCR
Obj. mieszaniny 20-40 ml
Skład mieszaniny reakcyjnej
- matrycowy DNA (lub RNA)
- 2 startery komplementarne do matrycy
- transmobilna polimeryzacja tag
- odpowiedni bufor
Etapy reakcji PCR
- denaturacja matrycowego DNA w temp ok 94 oC
- przyłączanie starterów do jednonicowych matryc DNA w temp. 40-68 oC
- synteza DNA - wydłużanie starterów przy udzielne polimerazy w temp 72 oC po zakończeniu elongacji do temperatury denaturacji DNA rozpoczyna kolejny cykl
- Po każdym cyklu następuje podwojenie amplifikowanego materiału. Nowo powstające produkty PCR są również matrycą do syntezy następnych
Zastosowanie reakcji PCR
- wykrywanie patogenów infekcyjnych: bakterii, wirusów, pasożytów
- wykrywanie zmian w genowym DNA w chorobach genetycznych
- preimplantacyjna i prenatalna diagnostyka chorób genetyczny
- wykrywanie uszkodzeń DNA
- wykrywanie predyspozycji do chorób nowotworowych
- wykrywanie polimorficznych sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej- ustalenie ojcostwa, identyfikacja sprawców przestępstw
- badanie głównego systemu z godności tkankowej w celu prawidłowego dobrania dawców i biorców przeszczepów.
Enzymy restrykcyjne (restryktazy)
- enzymy restrykcyjne to endonukleazy przecinające DNA w ściśle określonych miejscach (sekwencjach)
- naturalne elementy systemu obrany komórek bakteryjnych przed obcymi kwasami nukleinowymi
Klasy enzymów:
I - aktywność nukleazy i metylazy
- zależna od ATP Mg 2+ s- adenozylometaniny
- przecinają DNA w miejscu odległym od rozpoznania sekwencji
III- zależy od ATP Mg 2+ s-adenozylametoniny
- przecinają DNA poza rozpoznaną sekwencją (ok 25 nukleotydów)
II- zależne od Mg 2+
PFLP- polimorfizm dł. fragmentow restrykcyjnych
Polimorfizm- zmnienność genetyczna wynikająca z mutacji i może dotyczyć:
- pojedynczego nukleotydu- SNP (ang. single- nucleotiole polymorphism)
- dłuższej powtarzającej się wielokrotnie określonej sekwencji satlitarnej
- polimorfizm jest wykrywany jako zmienność długości fragmentów restrykcyjnych RFLP.
Analiza RFLP
- wykrywa różnice między długością fragmentów DNA pociętych restryktazami, które powstają w wyniku mutacji i tworzą lub eliminują rozpoznawane poprzez te enzymy
- pozwala na wykazanie powiązań rodzinnych poprzez porównywanie charakterystycznych wzorów.
SSCP- polimorfizm komformacji pojedynczych łańcuchów DNA sprawdzamy czy jest jakaś mutacja. pojedyncze nici DNA równej długości, ale różnią się sekwencjami a przez to strukturą trójwymiarową (konformacją) SS DNA mogą wykazywać różnicę w ruchliwości elektrofonetycznej.
różnice w sekwencji spowodowane mutacja punktową, wywołuje zróżnicowaną migrację i charakterystyczne położenie w żelu poliakrylamidowymi.
Hybrydacja z sondą molekularną
Hybrydacja jest to zdolność dwóch komplementarnych lub częściowo komplementarnych cząstek kwasów nukleinowych do tworzenia stabilnej hybrydacji o zasadach połączonych w pary powstaje hybryda (dupleks).
Hybrydacja może zachodzić między dowolnymi dwoma jedno niciowymi łańcuchami kwasów nukleinowych
-DNA:DNA
-DNA:RNA
-RNA:RNA
Łącznie z sondą zachodzi według reguły komplementarności zasad.
Sondy molekularne
Krótkie, jednoniciowe DNA
Sonda ma powinowactwo do ściśle określonej sekwencji DNA, wyposażone jest w znak umożliwiający jej wykrywanie po zakończeniu reakcji hybrydacji
Hybrydyzacja metodą Southerna
Zadaniem tego typu hybrydyzacji jest identyfikacja poszukiwanych sekwencji DNA w mieszaninie identyfikacja poszukiwanych sekwencji DNA w mieszaninie fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi
Metodę Southerna stosuje się do badania polimorfizmu DNA.
Etapy hybrydacji
Genomowy DNA trawiony jest wybranym enzymem restrykcyjnym
Fragmenty DNA otrzymane po trawieniu rozdziela się przez elektroforezę w zelu agarozowym
Zestaw fragmentów restrykcyjnych przenosi się z żelu agarozowego na błonę nylonową
Hybrydyzacja metoda Holter…