ZASTOSOWANIE KULTUR IN-VITRO W PRODUKCJI ROŚLIN OZDOBNYCH
Kultury `in-vitro' - aseptyczne kultury fragmentów rośłin ( tkanki , organy , merystemy , zarodki , protoplasty ) prowadzone w ściśle kontrolowanych warunkach ( w specjalnych pojemnikach i pomimieszczeniach).
Podstawą rozmnażania roślin w kulturach in vitro jest naturalna zdolność roślin do romnażania bezpłciowego , wykorzystywana również w innych metodach ich reprodukcji na drodze wegetatywnej oraz zdolność totipotencji komórek.
Totipotencja komórek roślinnych - nieograniczona zdolność komórek do dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów. W każdej komórce kompletny materiał genetyczny , co umożliwia odtworzenie nowej rośliny.
TOTIPOTENCJA
Dydeferencjacja - odróznicowanie się komórek i ich powrót do stanu merystematycznego
Redydeferencjacja - ponowne zróznicowanie się komórek dające możliwość regeneracji komórek i tkanek
POCZĄTKI KULTUR IN VITRO
1902 - Haberland , pierwsze doświadczenia
1936 - odkrycie auksyny IAA
1930-1940 - kultury kallusa
1939- pierwsze kultury roślinne
1950 - kultury merystemów , odwirusowywanie roślin
1956 - odkrycie kinetyny
1958 - zarodki somatyczne w kulturach zawiesinowych
1962 - opracowanie składu uniersalnejpozywki do kultur komórek , tkanek , organów roślinnych ( Murashige i Skoog )
1965 - opracowanie metody rozmnażania storczyków in vitro
Dalsze lata - zwiększanie puli odmianowej i gatunkowej rozmnażanej in vitro. Udoskonalanie metod. Automatyzacja i robotyzacja.
ZALETY KULTUR TKANKOWYCH
Nieduża ilość materłu rołślinnego potrzebna do założenia kultury
Zdrowy , wyrównany genetycznie i fenotypowo materiał
Bardzo wysoki współczynnik rozmnażania ( z 1 rośliny matecznej nawet 1 mln roślin w ciągu roku np. lilie , storczyki )
Całoroczna produkcja niezależna praktycznie od sezonu wegetacyjnego
Łatwość międzynarodowego obrotu i transportu ( mała waga , sterylny , wolny od patogenów materiał )
MOŻLIWOŚCI ZASTOSOWANIA KULTUR TKANKOWYCH
Klonowanie odmian heterozygotycznych
Odwirusowywanie , kultury izolowanych merystemów
Szybkie rozmnażanie , wprowadzenie na rynek nowych odmian
Wykorzystywane w inzynierii genetycznej
Zachowanie linii męskosterylnych , uzyskiwanie form haploidalnych , tetraploidalnych , fuzje protoplastów , mieszańce somatyczne
Długoterminowe przechowywanie cennego materiału roślinnego , banki genów. Zakładanie mateczników in-vitro . Przechowywane w niższej temperaturze w słabszym oświetleniu w labolatorium
Pozyskiwanie wtórnych metabolitów
Produkcja zarodków somatycznych i sztucznych nasion
Mechanizacja i automatyzacja produkcji ( bioreaktory)
Produkcja materiału roslinnego na bardzo dużą skalę
WADY KULTUR TKANKOWYCH
Metoda pracochłonna
Metoda kosztowna
Możliwość zakażeń
Wyjściowa roślina |
|
Rozmnażanie z wykorzystaniem isteniejących paków |
Rozmnażanie poprzez zarodki somatyczne |
Pobieramy merystem , albo pąk wierzchołkowy , po odkażeniu wykładamy na pożywkę. Następuje regeneracja. Bazujemy na merystemach , pobudzamy je do aktywności. |
Pobieramy eksplantat , następuje morfogeneza na drodze bezpośredniej ( na ekplantacie powstaja pąki przybuszowe , pędy , tworzą się zarodki somatyczne ) lub na drodze pośredniej - stadium kallusa , na kallusie pąki przybyszowe. |
PRODUCJA ROŚLIN IN-VITRO W MLN SZTUK
|
1995 - 1996 |
1998-1999 |
Europa |
160 |
179 |
Azja |
135 |
155 |
USA |
128 |
110 |
OGÓŁEM: |
783 |
822 |
PRODUKCJA GLOBALNA MIKROSADZONEK
ROK |
MLN SZTUK SADZONEK |
1986 |
130 |
1990 |
390 |
1993 |
663 |
1996 |
733 |
1998 |
822 |
W tym 90 % to rośliny ozdobne , paprocie , Syngonium , Calathea , Alocasia , Spathiphyllum, Ficus. Syngonium rozmnażane metodą in-vitro ma ładny , zwarty pokrój. Rozmnażane także byliny ogrodowe - ostróżki ( Delphinium ) , hosty ( Funkia ) , żurawki ( Heuchera ) , rośliny wodne , sukulenty , krzewa , drzewa - różaneczniki ( Rhododendron ) , magnolie ( Magnolia ) , powojniki (Clematis ) oraz rośliny cebulowe i bulwiaste.
LABOLATORIA KOMERCYJNE
USA - ponad 100
Europa Zachodnia - 250
Holandia - 67
Polska - 40 ( 50 mln sztuk rocznie mikrosadzonek)
Niemcy - 21
ROCZNA PRODUKCJA MIKROSADZONEK W LABOLATORIACH IN VITRO W MLN SZTUK
Europa - 200
USA - 110
Indie - 130
Europa i Usa - 70 % rośliny ozdobne , 10-15 % rośliny drzewiaste
Europa - poniżej 1 % warzywa
USA - 10 % warzywa
Indie - ananasy , palmy , bananowce , papaje ( przemysł spożywczy )
LABOLATORIUM KULTUR TKANKOWYCH
Pomieszczenie do przygotowywania szkła i pożywek
Pokój do pracy w warunkach sterylnych
Pokój do wzrostu kultur
Pokój do mycia i przechowywania szkła
Chłodnia w duzych labolatoriach do przechowywania roślin
Pokój do obserwacji
Pomieszczenia socjalne i biurowe
Pomieszczenie do przygotowywania szkła i pożywek - wyposażenie:
Zlew
Urządzenie do destylacji wody
Autoklaw
Stoły
Lodówka , zamrażarka
Szafki na odczynniki i szkło
Wagi
Mieszadła magnetyczne
Kuchenka elektryczna
pH-metr
urządzenie dozujące pożywkę
mikroskop
Pokój do pracy w warunkach sterylnych
Stół z laminarnym przepływem powietrza ( filtr HEPA )
Palnik gazowy
Urządzenie do sterylizacji narzędzi
Mikroskop
Wózki
Narzędzia: pęsety , skalpele , środki odkażające
Pokój do wzrostu kultur
Półki z oświetleniem
Zegar sterujący oświetleniem i temperaturą
Klimatyzator
Ewentualnie wytrząsarka , rotor - do kultur płynnych
ETAPY ROZMNAŻANIA
Stadium inicjalne( eksplantaty inicjalne: wierzchołki pędów)
Namnażanie pędów
Ukorzenianie pędów
Aklimatyzacja - przystosowanie roślin do gorszych warunków , aklimatyzujemy stopniowo. Często etap ukorzeniania łączy się z aklimayzacją.
Eksplantat - fragment rośliny umieszczony na specjalnejpozywce w warunkach in vitro
Eksplantat inicjalny - fragment rołśiny wykorzystywany do założenia całej kulury in vitro
EKSPLANTATY INICJALNE
merystemy
wierzchołki pędów
fragmenty pędów(jeden, dwa węzłami)
pąki
fragmenty kwiatostanów/ kwiatów
fragmenty liści( blaszki liściowe, ogonki liściowe)
nasiona/ zarodki, siewki
fragmenty cebul, bulw, kłączy, rozłogów
fragmenty korzeni
Przygotowywanie eksplantatów pierwotnych( inicjalnych)
Przygotowanie rośliny matecznej - jeśli pozyskujemy korzenie to przesadzamy roślinę do warunków bezglebowych , jeśli rośnie w gruncie , przesadzamy do szklarni
Pobieranie fragmentów roślinnych - fragmenty większe niż ostateczne wykładane na pozywki. Pobieramy w godzinach porannych. Jak najszybciej umieszczamy na pozywce. Ścinając umieszczamy na wilgotnej bibule , można przetrzymać w lodówce
Odkażanie eksplantatów- umycie w ciepłej wodzie z mydłem , dezynfekcja ( etanol , podchloryn sodu lub wapnia , nadtlenek wodoru ). Odkażania wymagają szczególnie rośliny pokryte włoskami czy woskiem. Dodajemy preparatu zmniejszającego napięcie powierzchniowe. Następnie 3-5 krotne płukanie w sterylnej wodzie.
RODZAJE POŻYWEK
Stałe
Płynne
Półpłynne
Dwufazowe - dolna warstwa zestalona , górna płynna
SKŁAD POŻYWEK
Sole nieorganiczne: makro i mikroelementy
Związki organiczne: węglowodany, witaminy, regulatory wzrostu, aminokwasy, hydrolizat kazeiny, substancje zestalające( Agar, Phytagel, Gelrite)
Pożywka musi mieć określone pH - 5,7-5,8. Wrzosowate wymagaja niższego odczynu. Część pożywek sterylizuje się na zimno a nie w autoklawie.
Węglowodany
Sacharoza (najczęściej )
Maltoza
Cukry proste: fruktoza, glukoza
D- mannitol
D- sorbitol
Witaminy
Kw. Nikotynowy
Inozytol
Ryboflawina
Tiamina
Pirydoksyna
Regulatory wzrostu
Auksyny
Cytokininy
Gibereliny
Kw. abscysynowy
Inne: Tiba, Ancymidol, Paclobutrazol , CDA , TIBA
Auksyny
Powodują wzrost wydłużeniowy pędów, indukcję kallusa, stymulują wzrost i podziały kom., tworzenie się pąków przybyszowych; jako zw. stymulujące powstawanie korzeni; stosowane przy procesie somatycznej embriogenezy , w etapie namnażania pędów
Cytokininy
Stymulują podziały kom., namnażanie pędów, proliferacji pąków przybyszowych, hamują wydłużanie pędów, wzrost korzeni, procesy starzenia; stosowane głównie na etapie namnażania pędów
Gibereliny
Wpływają na wzrost kom., wzrost wydłużeniowy pędów, znoszą spoczynek nasion, zarodków somatycznych, pąków szczytowych i cebulek przybyszowych, hamują wzrost kallusa
Kwas abscysynowy
Stymuluje dojrzewanie zarodków somatycznych, tworzenie się cebulek i bulw przybyszowych, ułatwia aklimatyzację, stymuluje spoczynek
ZAKAŻENIA
Pierwotne - przy zakładaniu kultury
Wtórne - w trakcie prowadzenia kultury
Źródła zakażeń mikrobiologicznych
Eksplantaty
Personel
Niesprawne filtry/ wentylacja
Niesterylne pożywki
Niesterylne narzędzia
Szkodniki
Warunki pracy personelu
Mycie rąk , praca w rękawiczkach
Dezynfekcja ( 70 % etanol )
Czyste fartuchy
Praca w czapce, masce
Praca w głebi komory
Ograniczenie rozmów
Szkodniki - źródła
Materiał roślinny
Wnoszone przez personel
Wentylacja
Zapobieganie zakażeniom
Czysta odzież
Zmiana odzieży po wyjściu ze szklarni
Maty okażające
Zabezpieczenie kultur folią
Środki chemiczne
STERYLIZACJA I ODKAŻANIE
Pożywki - autoklaw 121 stopni C ; 0,1 MPa ; 15-20 min
Narzędzia - odkażanie etanolem , opiekanie nad palnikami
2
2