ZAKŁAD BIOCHEMII ENZYMOLOGIA Biochemia i Biotechnologia

UMCS (KP/KR) 2012

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH - I

Ćwicz. 1-2

Podstawy kinetyki reakcji enzymatycznych zostały stworzone dzięki modelowi kinetycznemu, jaki w 1913 r. zaproponował Leonor Michaelis i Maud Menten do ilościowego opisu reakcji enzymatycznej w oparciu o prowadzone przez nich badania aktywności inwertazy.

Zastosowanie tego właśnie enzymu do badań praktycznych na ćwiczeniach zostało dodatkowo podyktowane zarówno dostępnością enzymu i substratu, jak też stosunkowo niskimi kosztami odczynników.

Inwertaza (sacharaza) według obowiązującej nomenklatury enzymów jest β-D-fruktozydazą (EC 3.2.1.26), należy do klasy hydrolaz rozszczepiających wiązanie β-glikozydowe (glikozydaz - 3.2) w związkach O-glikozylowych (3.2.1). Działanie enzymu polega na hydrolizie końcowych nieredukujących reszt β-D-fruktofuranozydowych. W przypadku sacharozy (α-D-glukopiranozylo-β-D-fruktofuranozy) produktem hydrolizy jest D-glukoza i D-fruktoza (cukier inwertowany). Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją ze względu na towarzyszącą temu zjawisku zmianę skręcalności właściwej z [α]_D= 66,6^o na [α]_D= −20^o.

Inwertaza jest enzymem rozpowszechnionym w roślinach, jednak najlepszym źródłem otrzymywania jej preparatów są drożdże piwne lub piekarskie, w których występuje ona w najwyższym stężeniu. Inwertaza jest enzymem wewnątrzkomórkowym i do jego ekstrakcji konieczne jest rozbicie błon komórkowych. Istnieje szereg metod otrzymywania i oczyszczania preparatów inwertazy. Do izolacji enzymu można stosować np. autolizę (przez kilka godzin w 0,1M NaHCO₃, w temp. 40^oC), rozbicie komórek za pomocą homogenizatora ostrzowego lub przez ucieranie drożdży z piaskiem w obecności eteru i ekstrakcję białek wodą.

Do oczyszczania inwertazy można wykorzystywać jej małą podatność na strącanie kwasem pikrynowym. Wytrącanie enzymu przeprowadza się też acetonem w niskiej temperaturze (ochrona przed denaturacją).

Zasada oznaczania aktywności inwertazy opiera się na pomiarze stężenia cukrów redukujących (glukozy i fruktozy) pojawiających się w miarę postępowania enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Roztwór, w którym znajdują się uwolnione podczas hydrolizy monosacharydy gotuje się z odczynnikiem zawierającym miedź dwuwartościową (mieszanina odczynników Somogyi I i II, w stosunku 4:1). Powstający w wyniku redukcji ceglasty osad Cu₂O rozpuszcza się następnie w odczynniku Nelsona (arsenomolibdenowym) i uzyskuje roztwór o niebiesko-zielonym zabarwieniu, którego absorbancję odczytuje się przy długości fali 520 nm. Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do stężenia powstałego produktu.

Otrzymywanie preparatu inwertazy (Ćwicz. 1A)

Do izolacji inwertazy zastosowano homogenizację drożdży ze względu na wystarczająco wysoką do dalszych badań aktywność otrzymanego preparatu i krótki czas trwania procedury.

Wykonanie:

10 g świeżych drożdży piekarskich zhomogenizować w 50 ml zimnej wody destylowanej za pomocą homogenizatora ostrzowego (5 tys. obrotów/min., przez 2 min.). Podczas homogenizacji należy utrzymywać niską temperaturę za pomocą mieszaniny wody z lodem. Homogenat odwirować (w wirówce K−23 po wyważeniu gilz parami) przy 3 tys. obrotów/min., przez 15 min. Uzyskany supernatant, zawierający surowy enzym, zlać do dwóch podpisanych naczynek i jedno z nich przechowywać w lodówce (+4°C), a drugie w temp. −20°C (po zamrożeniu). W razie potrzeby supernatant należy przesączyć przez Miracloth.

Do dalszych badań będzie używany otrzymany preparat inwertazy, po odpowiednim rozcieńczeniu - bezpośrednio przed oznaczeniami.

Wyznaczanie optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (Ćwicz.2)

Przygotować dwa różne rozcieńczenia (w zimnej H₂O dest.) preparatu inwertazy otrzymanego na poprzednich ćwiczeniach (ćwicz. 1A) - np.50- i 100-krotne.

Do probówki zawierającej 3 ml roztworu enzymu o odpowiednim rozcieńczeniu dodać 3 ml 0,2 M roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7.

Natychmiast po wymieszaniu (próba odczynnikowa), a następnie dokładnie po 5, 10, 15, i 30 min. pobierać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do probówek zawierających po 4 ml buforu glicynowego o pH 10 (w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej).

Po wymieszaniu, z każdej z tych probówek przenieść po 1 ml roztworu do odpowiednio oznakowanych probówek (z korkiem) zawierających 1 ml świeżo przygotowanej mieszaniny odczynników Somogyi I i II. Probówki należy szczelnie zatkać i ogrzewać przez 15 min. we wrzącej łaźni wodnej.

Po ostudzeniu pod bieżącą wodą dodać po 1 ml odczynnika Nelsona, intensywnie wymieszać (micro-shaker) aż ustanie wydzielanie pęcherzyków gazu i cały Cu₂O rozpuści się, a następnie (po około 5 min.) dodać 2 ml H₂O i wymieszać (przez odwracanie probówek zatkanych korkami).

Po dokładnym wymieszaniu odczytać absorbancję dla poszczególnych wariantów czasu (5, 10, 15, i 30 min.) przy długości fali 520 nm wobec próby odczynnikowej (t=0).

Z przygotowanej wcześniej krzywej kalibracyjnej (ćwicz. 1B) odczytać stężenie (μg/ml) monosacharydów uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Przy wyborze rozcieńczenia preparatu enzymatycznego do dalszych badań należy kierować się tym, aby przewidywane wartości absorbancji mieściły się w wiarygodnym zakresie krzywej kalibracyjnej.

Wyznaczanie krzywej kalibracyjnej (Ćwicz. 1B)

1. Przygotować szereg probówek (z korkiem) zawierających po 1 ml odpowiednio rozcieńczonego buforem glicynowym (pH 10) wzorcowego roztworu glukozy-fruktozy (10 mg% ) według następującego schematu.

nr probówki	μl roztworu wzorcowego (10 mg%)	μl buforu glicynowego	Końcowe stężenie (μg/ml)
1 (odczynnikowa)	0	1000	0
2	100	900	10
3	200	800	20
4	300	700	30
5	400	600	40
6	500	500	50
7	750	250	75
8	1000	0	100

Po dokładnym wymieszaniu zawartości probówek, do każdej z nich wlać po 1 ml świeżo przygotowanej mieszaniny odczynników Somogyi I i II (w stosunku 4:1).

Probówki (szczelnie zatkane korkami) ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min. Po ostudzeniu pod bieżącą wodą dodać po 1 ml odczynnika Nelsona, intensywnie wymieszać (micro-shaker) aż ustanie wydzielanie pęcherzyków gazu i cały Cu₂O rozpuści się, a następnie (po około 5 min.) dodać 2 ml H₂O i dokładnie wymieszać (przez odwracanie probówek zatkanych korkami).

Odczytać wartości absorbancji dla poszczególnych stężeń wobec próby odczynnikowej (nr 1) przy długości fali 520 nm. Wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć na jej podstawie współczynnik kalibracji f.

Współczynnik kalibracji f (μg/ml ) = c wzorca (μg/ml )/ A₅₂₀ wzorca

2. Wyznaczyć krzywą kalibracyjną dla mniejszych stężeń glukozy-fruktozy (dla zakresu stężeń 0-10 μg/ml), stosując jako wyjściowy do rozcieńczania (analogicznie jak w tabeli powyżej) roztwór o stężeniu 1 mg% (przygotowany z r-ru o stęż. 10 mg%).

Wszystkie pozostałe czynności wykonać zgodnie z procedurą podaną powyżej (w punkcie 1.)

Odczynniki

1. Świeże drożdże piekarskie

2. 0,1 M bufor octanowy (octan sodu - kwas octowy) o pH 4,7

3. 0,2 M roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7

4. 0,1 M bufor glicynowy (glicyna - NaOH) o pH 10

5. 10 mg% roztwór wzorcowy glukozy-fruktozy w buforze glicynowym o pH 10

6. Odczynnik Somogyi I

288 g Na₂SO₄ (bezw.) rozpuścić w 1 l H₂O dest. Dodać 24 g soli Rochelle'a (winian sodowo potasowy), 48 g Na₂CO₃, 32 g NaHCO₃. Roztwór rozcieńczyć do 1600 ml gotowaną H₂O dest. i przechowywać w temp. 27^OC.

7. Odczynnik Somogyi II

72 g Na₂SO₄ (bezw.) rozpuścić w 300 ml wrzącej H₂O dest. Dodać 8 g CuSO₄ x H₂O. Roztwór rozcieńczyć do 400 ml gotowaną H₂O dest. i przechowywać w temp. 27^OC.

8. Mieszaninę odczynników Somogyi I i Somogyi II (stosunku 4:1) przygotowują studenci bezpośrednio przed użyciem.

9. Odczynnik Nelsona

100 g molibdenianu amonu rozpuścić w 1,8 l H₂O dest. Dodać 84 ml stęż. H₂SO₄ i roztwór arsenianu sodu ( 12 g Na₂H-arsenian w 100 ml H₂O). Odczynnik przechowywać w ciemnej butelce szklanej przez 24-48 godz. w temp. 37^OC, potem w pokojowej.

10. Zimna woda destylowana

11. Lód

Sprzęt

1. waga techniczna

2. homogenizator ostrzowy

3. wirówka K-23

4. łaźnia wodna (100^oC)

5. micro-shaker (wytrząsarka)

6. spektrofotometr

7. stoper

8. probówki ze szczelnymi korkami

9. probówki krótkie

10. pipety automatyczne

11. cylindry miarowe, zlewki, kolbki (poj. 50, 100, 250 ml)

2

---