Glikoliza

Szlak Embdena-Meyerhofa

(Warburga, Parnasa)

• Zachodzi zasadniczo we wszystkich komórkach

• Składa się z 10 reakcji - takich samych we wszystkich komórkach ale zacho-dzących w różnych komórkach z różną szybkością i różnymi mechanizmami regulacyjnymi

• Zachodzi w dwóch fazach:

1. Przekształcenie glukozy w 2 cząst. aldehydu 3-fosfoglicerynowego

2. Produkcja dwóch cząsteczek pirogronianu

• W fazie pierwszej zużywane są 2 cząst ATP, w fazie drugiej syntetyzowane są 4 cząst. ATP, zysk netto wynosi więc 2 cząst. ATP z jednej cząst. glukozy

• Produktami glikolizy są pirogronian, ATP i NADH

• Pirogronian w warunkach tlenowych ulega utlenieniu do CO₂ poprzez cykl kwasów trójkarboksylowych, w warun-kach beztlenowych pirogronian ulega przekształceniu w mleczan (np. w mięśniach) lub w etanol (drożdże)

• Glikoliza przekształca w ATP część energii metabolicznej zawartej w glukozie

• Zmiana energii swobodnej w wyniku konwersji 1 mola glukozy do 2 moli mleczanu wynosi -183.6 kJ/mol

C₆H₁₂O₆ → 2H₃C-CHOH-COO^- + 2H⁺

• Produkcja 2 cząst. ATP w glikolizie wymaga dostarczenia energii:

2ADP + 2P_i → 2ATP + 2H₂O

ΔG⁰' = 2 x 30.5 kJ/mol = 61 kJ/mol

• Glikoliza sprzęga dwie powyższe reakcje:

Glukoza+2ADP+2P_i→2 mleczany+2ATP+2H⁺+2H₂O

ΔG⁰' = -183.6+61 = -122.6 kJ/mol

Tak więc w standardowych warunkach 61/183.6x100% = 33% energii swobodnej rozkładu glukozy zachowane zostaje w ATP. W warunkach rzeczywistych stężenie reagentów, pH, wpływ metalu powodują, że 50% energii swobodnej rozkładu glukozy przekształcane jest w ATP

I Faza glikolizy

Pierwsza reakcja - fosforylacja glukozy przez heksokinazę

• Reakcja endoergiczna, wymagająca dostarczenia energii z hydrolizy ATP

Glukoza+ATP^4-→Glukozo-6-fosforan^2-+ADP^3-+H⁺

ΔG⁰' = -30.5 + 13.8 = -16.7 kJ/mol

ΔG = ΔG⁰'+RT ln([G-6-P][ADP]/[Glu][ATP])

ΔG=-6.7kJ/mol+(8.3J/molxK)(310K)ln([0.08][0.14]/[5][1.85])

ΔG = -33.9kJ/mol

• Fosforylacja zatrzymuje cząsteczki glukozy wewnątrz komórki (glukoza swobodnie dyfunduje przez błony komórkowe)

• Konwersja glukozy do glukozo-6-fosforanu utrzymuje niskie wewnątrzko-mórkowe stężenie glukozy, zwiększając tym samym dyfuzję glukozy do komórki

• Heksokinaza jest jednym z trzech enzy-mów regulujących szybkość glikolizy, wymaga do aktywności jonów Mg²⁺. K_m wobec glukozy wynosi dla zwierzęcej heksokinazy 0.1 mM, przy stężeniu glukozy we krwi równemu 4 mM. Różne tkanki mają różne izoenzymy kinazy różniące się nieco kinetycznymi włas-nościami. Zwierzęcy enzym jest allosterycznie inhibowany przez produkt reakcji - glukozo-6-fosforan.

• Heksokinaza jest mało specyficzna, może fosforylować cały szereg heksoz

• W wątrobie jest specyficzna wobec D-glukozy glukokinaza z K_m = 10 mM, nie podlegajaca inhibicji przez produkt reakcji. Wysoka K_m powoduje, że odgrywa ona rolę tylko wtedy jeśli w wątrobie mocno wzrasta poziom glukozy. Powstający w wyniku działania tego enzymu glukozo-6-fosforan używany jest do syntezy glikogenu. Poziom glukokinazy jest indukowany i regu-lowany przez insulinę

• Glukozo-6-fosforan jest kluczowym metabolitem wielu przemian metabo-licznych

2 reakcja glikolizy - izomeryzacja glukozo-6-fosforanu katalizowana jest przez izomerazę glukozofosforanową

• Tlen karbonylowy glukozo-6-fosforanu przesuwany jest z węgla C1 na C2

• Aldoza ulega przekształceniu w ketozę - fruktozo-6-fosforan

• Powstająca w wyniku izomeryzacji grupa hydroksylowa (na C1) jest łatwiejsza do fosforylowania w następnym etapie glikolizy w porównaniu z hemiacetalem obecnym na C1 przed izomeryzacją

• Obecność grupy karbonylowej na C2 (po izomeryzacji) aktywuje węgiel C3 i umo-żliwia rozerwanie wiązania w czwartej reakcji glikolizy

• U ludzi izomeraza glukozofosforanowa wymaga Mg²⁺, jest bardzo specyficzna wobec glukozo-6-fosforanu

• ΔG⁰' wynosi 1.67 kJ/mol, w warunkach komórki ΔG wynosi -2.92 kJ/mol. Oznacza to, że reakcja jest w stanie równowagi i łatwo odwrócić jej bieg

3 reakcja glikolizy - fosfofruktokinaza fosforyluje fruktozo-6-fosforan do fruktozo

1,6-bisfosforanu (ΔG⁰'=16.3 kJ/mol).

• Reakcja jest endoergiczna i wymaga sprzężenia z hydrolizą ATP

• Reakcja ta jest drugim, kluczowym etapem kontrolującym glikolizę

• ATP jest allosterycznym inhibitorem fosfofruktokinazy, AMP odwraca inhi-bicję. Poziom ATP jest stosunkowo stały, np. przy intensywnym wysiłku poziom ATP w mięśniach spada o 10%. Zmiany w intensywności glikolizy są znacznie większe, czynnikiem powodującym te zmiany jest AMP

• Poziom AMP wzrasta intensywnie przy obniżeniu poziomu ATP w komórce dzięki działaniu kinazy adenylowej

ADP + ADP⇔ATP + AMP

K_eq = [ATP][AMP]/[ADP]²=0.44

Poziom ADP wynosi 10%, a poziom AMP 1% poziomu ATP, stąd niewielkie zmiany w stężeniu ATP powoduja o wiele większe zmiany w stężeniu AMP dzięki działaniu kinazy adenylowej

Przykład: Stęż. ATP w komórce (erytrocyt) wynosi 1850 μM, ADP - 145 μM, AMP - 5μM, całkowite stężenie nukleotydów adeninowych - 2000μM. 8% ATP jest nagle zhydrolizowane do ADP. Poziom ATP zmniejsza się 1850 x 0.92 = 1702μM, poziom [AMP] + [ADP] zmienia się do

2000 - 1702 = 298μM. Poziom AMP można wyliczyć z równania stanu równowagi dla tej reakcji:

0.44 = [1702μM][AMP]/[ADP]²

Ponieważ [AMP] = 298μM - [ADP], to

0.44 = 1702(298 - [ADP])/[ADP]²

stąd: [ADP] = 278μM, [AMP] = 20μM

W wyniku reakcji nastąpił (przy 8% spadku poziomu ATP) 400% wzrost poziomu AMP

• Allosterycznym inhibitorem fosfofrukto-kinazy jest cytrynian - wiąże to glikolizę z cyklem kw. cytrynowego. Wysoki poziom cytrynianu zwalnia glikolizę

• Allosterycznym aktywatorem fosfo-fruktokinazy jest fruktozo-2,6-bisfosforan, zwiększa on powinowactwo enzymu do substratu i zmniejsza inhibitorowy efekt ATP

• Fruktozo-2,6-bisfosforan jest równo-cześnie inhibitorem fruktozo-1,6-bis-fosfatazy katalizującej reakcję przejścia fruktozo-1,6-bisfosforanu do fruktozo-6-fosforanu w neoglukogenezie

Reakcja 4 - Aldolaza fruktozofosforanowa katalizuje reakcję rozpadu fruktozo-1,6-bisfosforanu do aldehydu 3-fosfogli-cerynowego i fosfodihydroksyacetonu

C₆ → 2C₃

• K_eq dla tej reakcji wynosi 10^-4M, a ΔG⁰'=

23.9 kJ/mol, sugeruje to jej małą efektywność

• Jednak w warunkach komórki szybkie usuwanie produktów powoduje, że reakcja ma ΔG= -0.236 kJ/mol

• Istnieja dwie klasy aldolaz. Aldolaza klasy I (zwierzęta) nie wymaga dwuwartościowych kationów, nie jest więc hamowana przez EDTA. W obecności substratu hamuje ją NaBH₄. Aldolaza klasy II (bakterie i grzyby) nie jest inhibowana przez borowodorek, zawiera w centrum aktywnym dwuwartościowy kation (zwykle Zn²⁺), inhibowana jest przez EDTA

Reakcja 5 - konwersja fosfodihydroksy-acetonu do aldehydu 3-fosfoglicerynowego przez izomerazę triozofosforanową

• Następuje przeniesienie atomu wodoru z C1 na C2 poprzez intermediat enolowy

• Jest to wewnątrzcząsteczkowa reakcja redoks

• Zarówno w przyłączeniu jak i odszczepieniu protonu uczestniczy jako katalityczna grupa zasadowa reszta Glu z centrum aktywnego enzymu

• Izomeraza triozofosforanowa jest przykładem kinetycznie perfekcyjnego

enzymu. k_kat/K_m wynosi 2 x 10⁸M^-1s^-1, bliski jest więc maksimum kontrolowanej przez dyfuzję szybkości wiązania z substratem

II faza glikolizy

• Reakcje przekształcające metaboliczną energię glukozy w ATP

• Z 2 cząsteczek aldehydu 3-fosfogli-cerynowego powstają 4 cząsteczki ATP, biorąc pod uwagę 2 cząsteczki ATP zużyte w I fazie glikolizy, zysk netto wynosi 2 ATP

• Faza II rozpoczyna się od utlenienia aldehydu 3-fosfoglicerynowego do wyso-koenergetycznego 1,3-bisfosfoglicery-nianu

• W następnej reakcji następuje fosforylacja ADP do ATP przez transfer reszty fosforanowej z 1,3-bisfosfogli-glicerynianu

• Powstający w powyższej reakcji 3-fosfo-glicerynian jest przekształcany w kilku krokach do fosfoenolopirogronianu - wy-sokoenergetycznego związku, który fos-forylując ADP do ATP przekształca się w pirogronian

Reakcja 6 - dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego katalizuje utlenianie aldehydu 3-fosfoglicerynowego do 1,3-bisfosfoglicerynianu

• Termodynamicznie niekorzystna reakcja - tworzenie acylofosforanu z kwasu karbonylowego jest częściowo napędza-na przez reakcję termodynamicznie korzystną - utlenianie aldehydu. Sprzężenie następuje przez tioestrowy intermediat

• Mechanizm reakcji polega na nukleofilowym ataku grupy hydrosul-fidowej cysteiny, w wyniku tego powstaje tiohemiacetal. Ten intermediat oddaje jon wodorkowy na NAD⁺. Powstaje zredu-kowany NADH i bogaty energetycznie tioester. NADH dysocjuje od enzymu, następna cząsteczka NAD⁺ wiąże się z centrum aktywnym. Następuje atak ortofosforanu na tioester i powstaje 1,3-bisfosfoglicerynian.

• Enzym może być inaktywowany przez jodooctan reagujący i blokujący grupę hydrosulfidową cysteiny z centrum aktywnego

• Z enzymem wiąże się arsenian, będący analogiem fosforanu. Powstaje 1-arseno-3-fosfoglicerynian, który jest niestabilny i szybko hydrolizuje do 3-fosfogli-cerynianu bez syntezy ATP. Następuje tzw. rozprzężenie fosforylacji substra-towej (na tym polega trujący charakter arsenianu)

Reakcja 7 - kinaza fosfoglicerynianowa przenosi grupę fosforylową z 1,3-bis fosfo-glicerynianu na ADP, tworząc ATP i 3-fos-foglicerynian

• Reakcja jest silnie egzoergiczna, napędza poprzednią reakcję glikolizy (przekształ-canie aldehydu 3-fosfoglicerynowego w 1,3-bisfosfoglicerynian):

aldehyd 3-fosfoglicerynowy + ADP + P_i + NAD⁺ →

3-fosfoglicerynian + ATP + NADH + H⁺

ΔG⁰' = -12.6 kJ/mol

• Napędzane są również wcześniejsze etapy (z aldolazą i izomerazą triozo-fosforanową)

• 1.3-bisfosfoglicerynian jest również substratem dla obocznego szlaku metabolicznego produkującego przy udziale bisfosfogliceromutazy 2,3-bisfosfoglicerynian - allosteryczny efek-tor hemoglobiny. Do reakcji potrzebny jest 3-fosfoglicerynian. Następuje tu transfer reszty fosforanowej z C1 1,3-bisfosfo-glicerynianu na C2 3-fosfogli-cerynianu, powstaje 2,3-bisfosfoglice-rynian i regenerowana jest nieobecna w sumarycznej stechiometrii reakcji cząsteczka 3-fosfoglicerynianu

Reakcja 8 - katalizowana przez fosfogliceromutazę, która przesuwa resztę fosforanową w 3-fosfoglicerynianie z węgla C3 na węgiel C2, tworząc 2-fosfoglicerynian

• Fosfogliceromutazy maja różny mecha-nizm działania, zależnie od źródła pochodzenia. Enzym z drożdży i mięśni królika ulega w czasie reakcji procesowi fosforylacji przez katalityczne ilości 2,3-bisfosfoglicerynianu. Enzym z kiełków pszenicy prowadzi wewnątrzcząstecz-kowy transfer reszty fosforanowej bez udziału 2,3-bisfosfoglicerynianu

Reakcja 9 - enolaza katalizuje tworzenie fosfoenolopirogronianu z 2-fosfoglice-rynianu. ΔG reakcji jest w warunkach komórki zbliżone do zera. Jak więc z substratu o niskiej energii swobodnej hydrolizy powstaje produkt o wysokiej energii swobodnej hydrolizy? Oba związki zawierają tę samą ilość potencjalnej energii metabolicznej. Rearanżacja w formę enolową umożliwia w następnym etapie wyzwolenie zgromadzonej energii potencjalnej.

Reakcja 10 - przekształcanie fosfoenolo-pirogronianu przez kinazę pirogronianową w pirogronian związane z syntezą ATP. Reakcja wymaga jonów Mg²⁺ i stymulo-wana jest przez jednowartościowe kationy

Fosfoenolopirogronian ^3- + H₂O → pirogronian + HPO₄^2-

ADP^3- + HPO₄²⁺+ H⁺ → ATP ⁴⁺ + H₂O

ΔG^0' = -62 +30.05 = -31.7 kJ/mol

Efekt stężenia redukuje wielkość ΔG^0' do

-23.06 kJ/mol. Wysoka energia swobodna hydrolizy fosfoenolopirogronianu wynika z konwersji enolowego tautomeru do bardziej stabilnej formy ketonowej

• Wysokie ujemne ΔG powoduje, że kinaza pirogronianowa jest trzecim enzymem regulującym przebieg glikolizy

• Kinaza pirogronianowa jest alloste-rycznie aktywowana przez AMP i fruktozo-1,6-bisfosforan, a inhibowana przez ATP, acetylo CoA i alaninę

• Wątrobowy enzym regulowany jest też przez kowalencyjną modyfikację. Glukagon aktywuje c-AMP-zależną kinazę białkową, która fosforyluje enzym, powodując silniejszą inhibicję przez ATP i alaninę i zwiększenie K_m wobec PEP (przy fizjologicznym stężeniu PEP enzym staje się wtedy nieaktywny i PEP może być wykorzystywany do glukoneo-genezy)

Ostateczne produkty glikolizy

• ATP, NADH, pirogronian

• NADH ulega recyklizacji do NAD, jeśli dostępny jest tlen to w szlaku transportu elektronów z syntezą ATP w fosforylacji oksydatywnej, w warunkach beztleno-wych NADH jest utleniany przez dehydrogenazę mleczanową i wraca do glikolizy

• Pirogronian w warunkach tlenowych przekazywany jest do cyklu kwasu cytrynowego

• W warunkach beztlenowych u drożdży pirogronian redukowany jest do etanolu przy równoczesnej reoksydacji NADH. Pierwszy etap tego szlaku polega na dekarboksylacji dekarboksylazą piro-gronianową do aldehydu octowego (konieczny pirofosforan tiaminy). Drugi etap - redukcja aldehydu do etanolu katalizowany jest przez dehydrogenazę alkoholową

• Innym typem fermentacji jest redukcja pirogronianu do mleczanu przez dehydrogenazę mleczanową. Zachodzi ona u bakterii, a także w tkankach zwierzęcych mających ograniczony dostęp do tlenu (np. rogówka oka, intensywnie pracujące mięśnie). Nagromadzony w mięśniach mleczan wędruje z krwią do wątroby, gdzie używany jest do resyntezy glukozy (glukoneogeneza)

Energetyka glikolizy

• W komórce (np. w erytrocycie) glikoli-tyczne reakcje nr 2 i 4-9 mają ΔG bliskie zeru, małe zmiany w stężeniu reaktantów mogą więc zmienić kierunek reakcji

• Heksokinaza (reakcja 1), fosfofruktoki-naza (reakcja 3) i kinaza pirogronianowa (reakcja 10) wykazują silnie ujemną wartość ΔG, są miejscem regulacji glikolizy. Inhibicja tych enzymów powoduje zatrzymanie tego szlaku metabolicznego.

Inne niż glukoza substraty glikolizy

Fruktoza

• W wątrobie jest fosforylowana na C1 przez fruktokinazę z udziałem ATP do fruktozo-1-fosforanu. Aldolaza fruktozo-1-fosforanowa rozkłada fruktozo-1-fosforan do aldehydu glicerolowego i fosfodihydroksyacetonu

• W nerkach i mięśniach fruktoza jest fosforylowana przez heksokinazę do fruktozo-6-fosforanu, który włącza się bezpośrednio w glikolizę

Mannoza jest fosforylowana przez heksokinazę do mannozo-6-fosforanu, ten konwertowany jest przez fosfomannozo-izomerazę do fruktozo-6-fosforanu i włączany w glikolizę

Galaktoza podlega (szlak Leloira) fosforylacji galaktokinazą do galaktozo-1-fosforanu, ten przekształcany jest w UDP-galaktozę przez urydylotransferazę galaktozo-1-fosforanu z równoczesną produkcją glukozo-1-fosforanu i zużyciem czasteczki UDP-glukozy. Reakcja ta zachodzi wg tzw. mechanizmu ping-pongowego z udziałem kowalencyjnego intermediatu enzymu z UMP. Powstały glukozo-1-fosforan jest przekształcany przez fosfoglukomutazę w glukozo-6-fosforan i włączany w glikolizę. Drugi produkt transferazy - UDP-galaktoza jest przekształcana w UDP-glukozę przez epimerazę UDP-glukozy

• Galaktozemia - defekt genetyczny- inaktywacja urydylotransferazy galakto-zo-1-fosforanu, nagromadzenie galaktozy - katarakta, uszkodzenie układu nerwowego. U dorosłych negatywny efekt mutacji może być częściowo niwelowany przez pirofosforylazę UDP-glukozy, która akceptuje jako substrat również galaktozo-1-fosforan

Glicerol - przekształcany jest przez kinazę glicerolową w glicerolo-3-fosforan, ten utleniany przez dehydrogenazę glicerolofosforanu do fosfodihydroksy-acetonu

1

10

---