Immunodiagnostyka

Podejmując się oceny układu odpornościowego w przebiegu choroby, należy uwzględnić zarówno elementy odporności nabytej jak i wrodzonej.

Rodzaje dostępnego materiału do oceny immunologicznej:

Istnieją tu bardzo szerokie możliwości gdyż elementy układu odpornościowego występują niemal we wszystkich tkankach, narządach czy płynach tkankowych

PŁYNY USTROJOWE:

• surowica lub osocze krwi, mocz, płyn z jamy opłucnej, wydzieliny błon śluzowych, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn z jamy stawowej:

• białka - u osób dorosłych mieszczą się w pewnych przedziałach ilościowych; u dzieci wykazują różnice w zależności od wieku

• przeciwciała, antygeny, składowe dopełniacza, kompleksy immunologiczne, cytokiny, złuszczone receptory cytokin, rozpuszczalne cząsteczki adhezyjne

ROZMAZY KOMÓRKOWE:

• Odwirowane komórki z płynów jako substraty do różnego rodzaju reakcji immunomorfologicznych

• Materiał z biopsji cienkoigłowej

Wykorzystanie: rutynowa diagnostyka morfologiczna; wykrywanie komórek produkujących przeciwciała (autoprzeciwciała); komórek różniących się pod względem składu antygenowego np. komórek nowotworowych

W zależności od sposobu utrwalania można określać czy cząsteczki znajdują się na powierzchni komórki czy też wewnątrzkomórkowo np. CD3 na limfocytach T.

SKRAWKI TKANKOWE:

W celu określenia topografii zmian w stosunku do struktur tkankowych konieczne jest badanie immunomorfologiczne skrawków tkankowych (mrożonych lub parafinowych).

ŻYWE KOMÓRKI:

Głównie pochodzące z krwi chorego. Służą do oceny zarówno cech fenotypowych jak i badań czynnościowych danej populacji komórkowej. Należy pamiętać, o ciągłym ruchu komórek krwi między układem limfatycznym i krwionośnym. Dlatego też nie można wysnuwać wniosków dotyczących całej puli limfocytów w ustroju.

MOŻLIWOŚCI OCENY IMMUNOLOGICZNEJ MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO

Ocena jakościowa:

• Obecność wykrywanej makrocząsteczki

Badanie pozwala stwierdzić nową jakość, np. obecność czynnika reumatoidalnego we krwi czy płynie stawowym lub też nadmiar lub niedobór składnika normalnie obecnego w badanym materiale (wahania składu białek w surowicy oceniane metodą immunoelektroforezy);

• Miejsce wykrywanej makrocząsteczki - złogi IgA i C3 w mezangium kłębuszków nerkowych w przebiegu nefropatii IgA - metody immunofluorescencyjne pośrednie lub bezpośrednie

Ocena półilościowa:

• Określanie miana surowicy. Miano jest to najwyższe rozcieńczenie surowicy dające jeszcze odczyn dodatni. (miano przeciwciał ANA, ANCA jako wskaźnik aktywności choroby)

• Liczenie komórek dodatnich w danym teście, zwykle w polu widzenia mikroskopu

Ocena ilościowa:

• do oceny czynników humoralnych: Ig, składowe dopełniacza, białka ostrej fazy (testy radioimmunologicze, immunoenzymatyczne, immunofluorescencyjne)

• do oceny czynników komórkowych: ocena subpopulacji komórek (metody cytometrii przepływowej)

Ocena czynnościowa: badanie funkcji żywych komórek in vitro

• Testy transformacji blastycznej limfocytów

• Zdolność do fagocytozy i produkcji rodników tlenowych przez granulocyty i monocyty

• Pojawianie się antygenów aktywacji na powierzchni komórek spoczynkowych CD25, CD69

Testy skórne (in vivo) pozwalają ocenić zachowanie różnych składników odpowiedzi immunologicznej na bodziec antygenowy

• Testy punktowe - alergeny wstrzykuje się śródskórnie

• Testy płatkowe - alergeny nakłada się bezpośrednio na skórę po delikatnej skaryfikacji naskórka

W zależności od czasu odczytu i rodzaju odczynu można określić rodzaj odpowiedzi immunologicznej (typ nadwrażliwości) lub jej brak

Ocena wpływu leczenia

Każdy rodzaj leczenia zarówno chirurgicznego jak i zachowawczego wywołuje określone skutki w układzie odpornościowym. Niekiedy prowadzi to do choroby np. toczeń polekowy, skutki chemio- i radioterapii

Ocena stanu odporności

Wywiad lekarski i badanie przedmiotowe

Dobrze przeprowadzony wywiad lekarski pozwala na wstępne podejrzenie istnienia zaburzeń funkcjonowania układu odpornościowego. Istotne jest uwzględnienie pytań o:

• Czas wystąpienia pierwszej infekcji

• Częstość i rodzaj zakażeń dróg oddechowych, układu pokarmowego, skóry

• Czynników etiologicznych

• Skuteczności leczenia

• Występowanie powikłań miejscowych i ogólnych po szczepieniach żywymi drobnoustrojami

• Wywiad rodzinny (wiele pierwotnych niedoborów odporności ma w większości autosomalny recesywny sposób dziedziczenia) - wywiad genetyczny; konstrukcja rodowodów w odniesieniu do chorób dziedziczących się recesywnie w sposób sprzężony z chromosomem X

W badaniu przedmiotowym bardzo istotna jest ocena rozwoju somatycznego, umysłowego, współistnienia innych zaburzeń np. endokrynologicznych, neurologicznych oraz występowania wad wrodzonych

Szczególną uwagę należy zwrócić na:

• Wykształcenie obwodowej tkanki limfatycznej

• Pewne charakterystyczne cechy fenotypowe: wygląd twarzoczaszki, zaburzenia kostnienia, zmiany skórne, stan uzębienia

Należy pamiętać, ze zmiany, które możemy oceniać mogą być bardzo dyskretne.

Wstępne badania diagnostyczne:

Wyniki podstawowych badań laboratoryjnych:

Morfologia krwi (spadek lub wzrost ilościowy elementów morfotycznych i przesunięcia we wzajemnych proporcjach krwinek białych)

• zaburzenia liczby wszystkich krwinek białych lub wybiórczo limfocytów (niedobory odporności komórkowej); przewlekłe stany zapalne, autoimmunizacja

• zaburzenia liczby neutrofilów (zaburzenia ilościowe dotyczące komórek żernych)

• zaburzenia liczby eozynofilów np. eozynofilia (zespół Omenna), choroby pasożytnicze, alergie

• zaburzenia liczby płytek krwi np. trombocytopenia lub nieprawidłowy wygląd płytek (zespół Wiskotta - Aldricha, niedobór cząsteczek MHC klasy II)

• zaburzenia liczby erytrocytów np. niedokrwistość (zespoły niestabilności chromosomowych, anemia autoimmunohemolityczna)

Inne badania laboratoryjne:

• Stężenie białka całkowitego i rozdział elektroforetyczny z podaniem odsetka poszczególnych frakcji

• Ocena białka C-reaktywnego (CRP)

• Ocena miana ASO (antystreptolizyn) i czynnik reumatoidalnty metodą lateksową

• Podwyższone wartości alfa-fetoproteiny (zespół ataksja teleangiektazja)

• Niskie poziomy wapnia i fosforu w surowicy krwi (zespół DiGeorge'a)

• stężenie chlorków w pocie (mukowiscydoza)

• IgE, sIgE, punktowe testy skórne (alergie)

• rtg klatki piersiowej lub badanie usg dla oceny grasicy. Brak lub zmniejszenie cienia grasicy (niemowlęta) jest cechą charakterystyczną większości pierwotnych niedoborów odporności komórkowej szczególnie

• zespołu DiGeorge'a,

• zespołu ataksja teleangiektazja,

• ciężkiego złożonego niedobou odporności (SCID),

• wykluczenia zakażenia HIV,

Wszystkie badania immunologiczne, choć często mają znaczenie kluczowe dla rozpoznania, prognozowania, czy monitorowania choroby, są jednak badaniami dodatkowymi, które muszą być rozpatrywane w kontekście wszystkich danych klinicznych i innych badań laboratoryjnych. Ich dobór powinien być staranny, gdyż są to badania kosztowne i często niedostępne w rutynowych laboratoriach.

Badanie odporności komórkowej:

1. Analiza składu limfocytów T we krwi obwodowej

• przy pomocy cytometrii przepływowej i odpowiednich przeciwciał monoklonalnych stały się rutynowymi w diagnostyce niedoborów odporności.

• Testami rozetowymi lub z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego (znaczenie historyczne)

Oceniamy:

• Odsetek i wartości bezwzględne limfocytów T (CD3), oraz ich subpopulacji CD4, CD8 oraz komórek NK

• Ekspresję antygenów klasy II MHC

• Receptor TCR lub jego składowe

• Komórki pamięci

Bardzo istotne znaczenie dla oceny składu limfocytów ma ustalenie wartości referencyjnych dla poszczególnych populacji komórek w odpowiednich grupach wiekowych.

2. Testy czynnościowe:

• ocena odpowiedzi proliferacyjnej ludzkich limfocytów po pobudzeniu mitogenami, antygenami, allogenami

• określenie ekspresji antygenów charakterystycznych dla komórek pobudzonych (np. receptora dla Il-2 CD25; wczesnego antygenu pobudzenia CD69; receptora transferyny CD71; antygenów HLA II klasy DR)

• testy skórne najczęściej z antygenami świnki, tężca, błonicy, grzybów

• aktywność cytotoksyczna komórek NK technikami cytometrii przepływowej

Ocena układu komórek żernych

1. Zaburzenia liczby neutrofilów

• Neutropenia, agranulocytoza - ocena szpiku - (wrodzone neutropenie, zespół Kostmana); przydatne immunoenzymatyczne oznaczanie stężenia G-CSF.

• Neutrofilia - histopatologiczne potwierdzenie braku komórek żernych w ogniskach zapalnych - (niedobór przylegania leukocytów)

2. Testy oceniające zdolność do wybuch oddechowego

• szkiełkowy test NBT - rutynowy do przesiewowej diagnostyki (przewlekłej choroby ziarniniakowej)

• chemiluminescencja neutrofilów

• metoda cytometrii przepływowej z zastosowaniem dihydrorodaminy

3. Ocena ekspresji receptorów powierzchniowych CD11b, CD18 i ich zmian po aktywacji metodą cytometrii przepływowej(niedobór przylegania leukocytów)

4. Chemotaksja neutrofilów np. do filtrów nitrocelulozowych w komorze Boydena

Ocena odporności humoralnej:

1. Oznaczanie stężeń immunoglobulin IgG, IgA, IgM, IgE:

• metodą nefelometryczną (IgG, IgA, IgM)

• metodą ELISA (podklasy IgG)

• metody dyfuzji radialnej w żelu (obarczone dużym błędem)

• metody immunoenzymatyczne z odczytem fluorescencyjnym -FAST (IgE)

• metody radioimmunologiczne (RIST, RAST)

Obserwowane zaburzone wartości surowiczych stężeń poszczególnych klas i podklas immunoglobulin są podstawą do dalszego różnicowania w kierunku zaburzeń odpowiedzi humoralnej

2. Ocena liczby krążących limfocytów B (CD19, CD20) ważne jest uwzględnienie norm wiekowych

• całkowity brak limfocytów B we krwi obwodowej - (agammaglobulinemia)

3. Ocena zdolności do syntezy swoistych przeciwciał i ich podklas:

• naturalnych izohemaglutynin (klasy IgM)

• przeciwciał powstałych po czynnej immunizacji standardowymi szczepionkami (błonica, tężec, polio, wzw typu B)

4. Ocena zdolności do syntezy przeciwciał in vitro przez :

• limfocyty stymulowane np. mitogenem szkarłatki (PWM)

• proliferację limfocytów B w odpowiedzi na bodziec receptorowy lub cytokinowy

Ocena układu dopełniacza

• Pomiar aktywności hemolitycznej dopełniacza CH50

• Metoda Mayera spektrofotometrycznie w różnych modyfikacjach

• Metody immunoenzymatyczne

Test odzwierciedla klasyczną drogę aktywacji dopełniacza wymagającą uruchomienia wszystkich składowych, tak więc brak któregokolwiek ze składników dopełniacza powoduje upośledzenie CH50

• Określenie stężenia poszczególnych składników w surowicy. Najczęściej stosujemy metody nefelometrii kinetycznej (C3,C4), immunodyfuzji radialnej (C1q, C2, C4, C5a), testy immunoenzymatyczne (C5b-C9)

NEFELOMETRIA

Jedna z metod opierająca się na technikach precypitacyjnych.

Stosowana do ilościowej oceny antygenu w badanym materiale. W reakcji precypitacji prowadzonej w środowisku płynnym powstający w wyniku reakcji antygen - swoiste przeciwciało kompleks immunologiczny powoduje zmętnienie roztworu, którego wielkość jest zależna od stężenia antygenu. Reakcję precypitacji prowadzi się w warunkach, w których stężenie antygenu jest bardzo niskie, natomiast stężenie przeciwciał wysokie. Ocenę zmętnienia danego roztworu dokonuje się poprzez pomiar natężenia światła rozproszonego przez cząstki roztworu. Do pomiarów stosuje się nefelometry (obecnie najczęściej laserowe) z silnym jednorodnym źródłem światła. Można stosować także spektrofotometry i fotometry wyposażone w odpowiednie przystawki.

Za pomocą technik nefelometrycznych oznacza się poziom immunoglobulin w płynach ustrojowych. Techniki te mają również zastosowanie w badaniach bakteriologicznych (np. określanie ilości bakterii w zawiesinie).

TEST ELISA (Enzyme Linked Immunososrent Assay)

Jedna z metod opierająca się na technikach immunoenzymatycznych.

Jeden z najczęściej stosowanych testów służących do ilościowej oceny w badanym materiale antygenu lub przeciwciała.

Powszechnie znalazł zastosowanie do wykrywania:

• Antygenów i przeciwciał w płynach biologicznych w przebiegu chorób zakaźnych i pasożytniczych

• Ilościowej oceny stężenia hormonów

• Wykrywania obecności autoantygenów

• Oznaczania podklas IgG

Test wykonuje się na gotowych mikropłytkach z dołkami.

I. Etap.Powierzchnię dołków opłaszcza się danym antygenem i po odpłukaniu nadmiaru reagentu dodaje się do dołków surowicę, w której poszukujemy przeciwciał, w kolejnych rozcieńczeniach.

II Etap: Po inkubacji płytkę przepłukuje się i dodaje przeciwciała wyznakowane enzymem mające zdolność wiązania się z immunoglobuliną

III Etap:

---