Temat 2: Morfologia komórki bakteryjnej. Barwienie złożone
Literatura:
Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str. 32-49, 78-84, 95-101,
Grabińska - Łoniewska A.: Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej. Politechnika Warszawska 1996, str. 13-19.
Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:
rozumieć procedurę barwienia Grama i umieć wykonać preparat barwiony tą metodą; znać różnice między bakteriami gramdodatnimi i gramujemnymi; wiedzieć, które formy morfologiczne komórek barwią się dodatnio, a które ujemnie metodą Grama; znać pojęcia: forma wegetatywna i forma przetrwalna bakterii; wiedzieć, co to są endospory i umieć wykonać preparat barwiony metodą Wirtza.
Najczęściej stosowaną w mikrobiologii techniką barwienia jest metoda Grama (od nazwiska duńskiego badacza). Jest to barwienie złożone pozytywne, w którym stosuje się kolejno dwa kontrastowe barwniki zasadowe: fioletowy (fiolet krystaliczny) i czerwony (fuksyna). Właściwy proces barwienia poprzedzony jest termicznym utrwaleniem preparatu. Barwienie to składa się z następujących etapów:
zabarwienia preparatu fioletem krystalicznym,
utrwalenia zabarwienia przez dodanie jodu w postaci płynu Lugola (roztwór J2 w KJ),
wymycia barwnika alkoholem,
dobarwienia preparatu barwnikiem kontrastowym - fuksyną.
Po dodaniu pierwszego barwnika wszystkie komórki barwią się na fioletowo. Dodanie płynu Lugola powoduje powstanie nierozpuszczalnego kompleksu fioletu krystalicznego z jodem. Kompleks ten jest następnie ekstrahowany 95 % alkoholem. Okazuje się, że te bakterie, które mają grubą warstwę mureiny (peptydoglikanu) w ścianie komórkowej nie tracą barwnego kompleksu i pozostają fioletowe po działaniu alkoholem. Te natomiast, których warstwa mureiny jest cienka, łatwo tracą barwnik i ulegają odbarwieniu. Aby je uwidocznić stosuje się drugi barwnik - kontrastowy, którym jest czerwona fuksyna zasadowa. W efekcie część komórek zabarwi się na fioletowo, a część na czerwono. Te pierwsze określa się mianem bakterii gramdodatnich, drugie mianem bakterii gramujemnych.
Barwienie Grama jest więc barwieniem różnicowym, gdyż pozwala zróżnicować bakterie na dwie podstawowe grupy, w zależności od tego, którym barwnikiem się zabarwią. Strukturalnym podłożem tych różnic jest przede wszystkim różnica w budowie ściany komórkowej.
Znaczenie barwienia Grama polega na tym, że różnice w barwliwości bakterii gramdodatnich i gramujemnych są skorelowane z innymi, bardziej istotnymi różnicami między nimi. Oto tylko niektóre z nich:
Bakterie gramdodatnie:
mają grubą ścianę komórkową z dużym procentowym udziałem mureiny,
są wrażliwe na penicylinę,
są wrażliwe na lizozym (enzym występujący np. we łzach), który rozpuszcza ich ścianę komórkową (a konkretnie peptydoglikan mureinę) pozostawiając tzw. protoplasty - komórki bez ściany,
są bardzo wrażliwe na detergenty anionowe,
część z nich ma zdolność wytwarzania przetrwalników (endospor).
Bakterie gramujemne:
mają cienką ścianę komórkową z niewielkim udziałem peptydoglikanu ale z dodatkową specyficzną błoną na zewnątrz ściany (tzw. błoną zewnętrzną),
są zwykle mało wrażliwe na penicylinę,
są odporne na działanie samego lizozymu,
są mało wrażliwe na detergenty anionowe,
nie mają zdolności do wytwarzania endospor.
Bakteriami gramdodatnimi są zasadniczo laseczki i ziarniaki, natomiast typowe pałeczki
(np. pałeczki jelitowe) są gramujemne. Barwliwość metodą Grama nie jest cechą stałą bakterii. Niektóre z nich, w zasadzie gramdodatnie, w starych hodowlach barwią się gramujemnie lub mozaikowato: część komórki jest fioletowa a część czerwona. Dlatego wiarygodny wynik barwienia dają tylko komórki pochodzące ze świeżych hodowli. Trzeba też wspomnieć, że nie wszystkie bakterie barwią się metodą Grama, np. prątki, zaliczane do promieniowców (w tym słynny prątek gruźlicy) mają ścianę tak silnie wysyconą substancjami lipidowymi i woskami, że barwniki nie wnikają do wnętrza ich komórek. Natomiast barwią się metodą Grama grzyby (np. drożdże), które zwykle są gramdodatnie.
Niektóre bakterie mogą występować zarówno w postaci komórek wegetatywnych, tzn. aktywnych metabolicznie i zdolnych do rozmnażania się, odżywiania, poruszania itd., jak i w postaci form przetrwalnych, których aktywność życiowa jest zahamowana. Najbardziej znaną formą przetrwaną są endospory, zwane też przetrwalnikami. Wytwarzają je głównie laseczki tlenowe z rodzaju Bacillus i laseczki beztlenowe z rodzaju Clostridium. Tworzą one endospory w niekorzystnych warunkach, szczególnie po wyczerpaniu się w podłożu substancji pokarmowych. Endospory są niezwykle odporne na wysoką temperaturę, wysychanie, promieniowanie, a także na działanie związków chemicznych, w tym barwników. W korzystnych warunkach są one zdolne przejść z powrotem w formę wegetatywną. W celu zabarwienia przetrwalników stosuje się specjalne metody z zastosowaniem wysokiej temperatury umożliwiającej przeniknięcie barwnika przez osłony endospor.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Zadanie 1. Wykonanie barwienia metodą Grama
Przygotowanie preparatu i utrwalenie go:
Odtłuścić na sucho szkiełko przedmiotowe pocierając je dość mocno kawałkiem mydła (z jednej strony), po czym usunąć jego resztki czystą szmatką.
Zapalić palnik gazowy i wyżarzyć w płomieniu ezę.
Po ostudzeniu ezy opalić korek i wylot probówki zawierającej zawiesinę bakterii przeznaczoną do barwienia.
Małym palcem tej ręki, która trzyma ezę wyciągnąć korek z probówki i (trzymając go) pobrać ezą hodowlę bakterii.
Opalić wylot probówki i korek, a następnie zamknąć nim probówkę.
Odstawić probówkę do statywu.
Wykonać rozmaz pobranej zawiesiny po odtłuszczonej powierzchni szkiełka.
Odłożyć preparat na ramki wanienki w celu wysuszenia.
Wyżarzyć ezę i odstawić ją do statywu.
Po wyschnięciu preparatu chwycić go pęsetą i trzykrotnie przesunąć nad płomieniem palnika (utrwalanie termiczne).
Barwienie metodą Grama:
.
Odczekać chwilę i zalać utrwalony preparat fioletem krystalicznym na 1,5 minuty.
Spłukać niewielką ilością wody i zalać płynem Lugola na 1,5 minuty.
Spłukać wodą i polewać alkoholem (denaturatem) do 30 sekund (nie dłużej !).
Spłukać dokładnie wodą.
Zalać fuksyną na 20 - 30 sekund (nie dłużej !).
Spłukać dokładnie wodą i wysuszyć przykładając delikatnie kawałki bibuły.
Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i położyć kroplę olejku imersyjnego na środek preparatu.
Nastawić obiektyw imersyjny (100x) i kręcąc śrubą makrometryczną obniżać go aż do momentu zetknięcia się czoła obiektywu z olejkiem.
Śrubą mikrometryczną nastawić ostrość i obserwować preparat.
Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj kolorowy rysunek.
Które typy morfologiczne bakterii barwią się metodą Grama dodatnio, a które ujemnie?
Zadanie 2. Wykonanie barwienia przetrwalników metodą Wirtza
1. Wykonać preparat utrwalony z zawiesiny laseczek Bacillus sp. jak w zadaniu 1
2. Zalać preparat wodnym roztworem zieleni malachitowej
3. Uchwycić preparat za pomocą szczypiec i podgrzewać nad płomieniem palnika do
pojawienia się pary, po czym odsunąć preparat znad płomienia i odczekać aż
przestanie parować
4. Czynność powtarzać przez 5 minut uzupełniając odparowujący barwnik
5. Odczekać, aż preparat ostygnie
6. Spłukać dokładnie wodą destylowaną
5. Dobarwić roztworem fuksyny fenolowej przez 1 minutę
6. Spłukać wodą i wysuszyć
7. Obserwować pod imersją jak w zadaniu 1.
Wykonaj kolorowy rysunek: