Maria Klechniowska i Sara Banerjee
Otrzymywanie pektyn z owoców cytryny i oznaczanie zawartości kwasu galakturonowego.
Pektyny są polisacharydami i oligosacharydami występującymi w ścianach komórkowych wielu roślin. Są to przede wszystkim poliuronidy składające się z połączonych ze sobą wiązaniami α-1,4-glikozydowymijednostek kwasu D-galakturonowego, w znacznej części zestryfikowanych grupami metylowymi. Wspólną cechą pektyn jest zdolność do tworzenia żeli w kwaśnych warunkach. Zdolność żelowania zależna jest od stopnia zmetylowania pektyn.
Wykonanie:
1. Ekstrakcja i oczyszczenie pektyn
Zhomogenizowałyśmy 100g cytryny i poddałyśmy ogrzewaniu w temp. 50°C, w celu przeprowadzenia nierozpuszczalnych pentoz zawartych w materiale roślinnym w rozpuszczalne w wodzie pektyny. Przesączyłyśmy przez gazę oraz przez warstwę ziemi okrzemkowej na lejku Buchnera.
Dzięki temu pozbyłyśmy się drobnych zanieczyszczeń, gdyż ziemia okrzemkowa jest dobrym materiałem filtracyjnym lepkich płynów.
Do oczyszczonego roztworu dodałyśmy etanol, co umożliwiło wytrącenie się pektyn o wysokim stopniu polimeryzacji.
Odwodniłyśmy preparat, przemywając go etanolem (miesza się z zawartą w preparacie wodą) oraz mieszaniną etanol : eter (eter miesza się z etanolem, a dzięki dużej lotności powoduje dehydratację preparatu)
Masa preparatu 28,5 mg.
Połowę preparatu zawiesiłyśmy w homogenizatorze Pottera i poddałyśmy wirowaniu, a następnie wytrąciłyśmy pozostałe w supernatancie pektyny i odwodniłyśmy jak poprzednio.
Masa preparatu 10 mg.
2. Oznaczanie kwasu galakturonowego
Z preparatów przed i po oczyszczeniu przygotowałyśmy wodne roztwory o stężeniu 50 ug/ml.W celu oznaczenia kwasu do przygotowałyśmy próbówki z czteroboranem sodu. Jony boranowe mają znaczenie katalityczne, zwiększają czułość reakcji oraz umożliwiają trwalsze zabarwienie. Do nich dodałyśmy
1- wodę (próba kontrolna) 2, 3 - roztwór pektyn przed oczyszczeniem, 4,5 - roztwór pektyn po oczyszczeniu 6,7 - roztwór wzorcowy kwasu galakturonowego. Do każdej z nich dodałyśmy karbazolu, który z kwasem galakturonowym daje fioletowe zabarwienie.
Należało wykonać pomiary absorbancji przy długości fali 530nm wobec próby kontrolnej.
*Niestety oznaczanie to zakończyło się niepowodzeniem, gdyż nieoczekiwanie fioletowe zabarwienie pojawiło się nawet w próbie kontrolnej, a pozostałe próby miały identycznie intensywną barwę. Przyczyną niepowodzenia był zanieczyszczony kwas siarkowy o złym stężeniu użyty do sporządzenia czteroboranu sodu.
Brak pomiarów absorbancji uniemożliwił obliczenie zawartości kwasu w preparatach przed i po oczyszczeniem.
3. Określanie składu jakościowego sacharydu
Próbkę oczyszczonych pektyn poddałyśmy hydrolizie dodając HCl-u i ogrzewając w łaźni z wrzącą wodą, a następnie przeprowadziłyśmy chromatografię podziałową na celulozie umożliwiającej rozdział związków mieszaniny. Na płytkę naniosłyśmy hydrolizat pektyn oraz wzorcowe roztwory cukrów i rozwijałyśmy ją w kamerze w układzie rozp. octan etylu : pirydyna : woda (12:4:4 v/v)
Fazą mniej polarną był octan etylu, który stanowił fazę ruchomą, natomiast fazą bardziej polarną była woda, która wniknęła we włókna celulozy. Użyta w układzie pirydyna zapewnia jednakową formę rozdzielanych związków.
Następnie wywołałyśmy chromatograf spryskując go roztworem azotanu srebra w acetonie. Jony srebra ulegają redukcji, natomiast cukry zawarte na płytce
utlenieniu. Po wysuszeniu spryskałyśmy płytkę roztworem NaOH w metanolu, zapewniło to zmianę środowiska na zasadowe, powstał tlenek srebra, który zabarwił
powierzchnię płytki na brunatny kolor. Dla odbarwienia tła spryskałyśmy płytkę
roztworem tiosiarczanu sodu. Pozostały widoczne jony Ag + w miejscu wystąpienia cukrów na płytce.
Rf1: 0,07 i 0,32 - naniesiony hydrolizat pektyn,
Rf2: 0,07 - kwas galakturonowy 0,9%,
Rf3: 0,26 - glukoza 0,9%,
Rf4: 0,32 - fruktoza 2%,
Rf5: 0,4 - ksyloza 0,7%,
Rf6: 0,63 ramnoza 2%
Najniższą wartość Rf posiada kwas galakturonowy, ponieważ zawiera grupę karboksylową, która jest bardzo polarna, przez co kwas nie migrował na płytce wraz z mniej polarna fazą- octanem etylu, a wykazywał powinowactwo do fazy wodnej.
Kolejną niską wartość Rf posiada glukoza, która jest substancją polarna ( zawiera dużo grup - OH).
Mniejszą polarnością charakteryzuje się fruktoza, dlatego ulokowana jest wyżej na płytce.
Następnie obserwujemy ksylozę, która zawiera o jedną grupę -OH mniej od fruktozy. Oznacza to, iż jest mniej polarna i wykazuje większe powinowactwo do migrującego octanu etylu.
Najmniej polarną substancją okazuje się ramnoza- ulokowana jest najwyżej na
płytce. Ramnoza posiada jedynie cztery grupy hydroksylowe i podstawnik CH3, który
znacznie obniża polarność.