Katarzyna Syka (sprawozdanie)

Beata Szymczak

Wydział: Biotechnologii i Nauk o Żywności

Kierunek studiów: biotechnologia

Rok studiów: III

Grupa: V

ĆWICZENIE NR 9

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA PEKTYN

Data wykonania ćwiczenia: 17.12.2008

Data oddania sprawozdania: 09.01.2009

Wprowadzenie

Substancje pektynowe stanowią grupę strukturalnych roślinnych heteropolisacharydów odpowiedzialnych za utrzymanie spójności tkanek. Podstawą budowy substancji pektynowych jest łańcuch złożony z kwasu α-D-galaktouronowego, którego reszty są połączone wiązaniami 1,4-α-glikozydowymi i w różnym stopniu zestryfikowane metanolem.

Substancje pektynowe są związkami szeroko rozpowszechnionymi w przyrodzie. Występują głównie w przestrzeni międzykomórkowej oraz w ścianie komórek roślinnych.

Właściwe pektyny są to polimery kwasu poligalaktouronowego, w którym znaczna liczba grup karboksylowych została zestryfikowana metanolem.

Kwasami pektynowymi nazywa się wielkocząsteczkowe polimery kwasu galaktouronowegu, w których tylko niewielka część grup karboksylowych jest zestryfikowana metanolem.

Kwas pektowy to kwas poligalakturonowy, którego reszty kwasowe nie są zmetoksylowane.

Enzymy pektynolityczne:

• Pektynoesteraza (EC 3.1.1.11)

Hydrolizuje wiązania estrowe w pektynie z uwolnieniem alkoholu metylowego

• Poligalakturonaza (EC 3.2.1.15)

Hydrolizuje wewnętrzne wiązania 1,4-α-glikozydowe w kwasie pektowym w sposób nieuporządkowany, wytwarzając oligopoligalakturonidy.

Enzymy te rozszczepiają jedynie wiązania glikozydowe sąsiadujące z wolną grupą karboksylową.

• Liaza pektynianowa (EC 4.2.2.10)

Rozszczepia wewnętrzne wiązania 1,4-α-glikozydowe w pektynie.

Enzymy te nie działają na kwas pektowy.

• Liaza pektatowa (EC 4.2.2.2)

Rozszczepia wewnętrzne wiązania glikozydowe w kwasie poligalakturonowym.

Enzymy te nie działają na pektyny.

Preparaty te stosuje się głównie w przemyśle spożywczym i winiarskim do:

- klarowania win,

- otrzymywania soków klarownych,

- zwiększania wydajności soku i właściwej ekstrakcji substancji barwnych i zapachowych,

- rozpłynniania surowców przy produkcji pulp, puree, nektarów.

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest poznanie metod oznaczania najważniejszych aktywności charakteryzujących preparaty pektynolityczne: ogólna aktywność pektynolityczna, aktywność pektynoesterazy, aktywność poligalakturonazy.

Część doświadczalna

Preparat pektynolityczny - pektopol

Oznaczenie ogólnej aktywności pektynolitycznej

Wykonanie:

Zmierzyłam czas wypływu przez kapilarę wiskozymetru wody destylowanej

o temperaturze 20^oC-t_H2O (sek).

Próba 1:

Do 20 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01M buforze octanowym o pH 3,8,

o temperaturze 20^oC, wprowadziłam 0,2 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszałam. Następnie odpowiednią ilość roztworu próby 1 (10-20 ml) wlałam do wiskozymetru i zmierzyłam czas wypływu-t_a (sek).

Próba 2:

Do 20 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01M buforze octanowym o pH 3,8,

o temperaturze 20^oC, wprowadziłam 0,2 ml odpowiednio rozcieńczonego tym buforem enzymu, dokładnie wymieszałam i inkubowałam w temperaturze 20^oCw ciągu 40 minut. Po tym czasie wlałam do wiskozymetru 10-20 ml roztworu próby 2 i zmierzyłam czas

wypływu- t (sek)

Obliczenia i wyniki:

Próba 1:

Z wzoru
wyliczam lepkość początkową roztworu pektyny.

t_a = 71,1 s

t_H2O = 45,7 s

Próba 2:

Z wzoru
wyliczam lepkość roztworu pektyny po określonym czasie działania enzymu.

t = 60 s

t_H2O = 45,7 s

Ogólną aktywność pektynolityczną, wyrażoną w ^oPM wyliczam ze wzoru:

gdzie:

A - procentowy spadek lepkości pektyny, zadanej preparatem enzymatycznym obliczamy ze wzoru:

T - czas, w którym nastąpił właściwy spadek lepkości (sek)

CE - stężenie preparatu enzymatycznego w roztworze pektyny (%)

Do 20 ml roztworu pektyny wprowadziłam 0,2 ml odpowiednio rozcieńczonego preparatu enzymatycznego. Przeliczając na 100 ml roztworu pektyny, ilość wprowadzonego preparatu wynosiłaby 1 ml. Z definicji stężenia procentowego wiadomo, że jest to ilość gramów substancji zawartej w 100 ml roztworu. Należy więc wyliczyć ilość g wyjściowego preparatu enzymatycznego w 1 ml użytego do reakcji roztworu enzymu.

Zatem: 20 ml roztworu pektyny + 0,2 ml preparatu enzymatycznego

100 ml roztworu pektyny + 1 ml preparatu enzymatycznego

Pektopol był rozcieńczony 200 razy, czyli: 1g / 200 ml = 0,005 g/ml

Ilość g preparatu w 1 ml rozcieńczonego roztworu enzymu jest równoznaczna z jego

stężeniem % w roztworze pektyny, czyli CE=0,005%.

% V_o - graniczna lepkość = 1,1

^oPM określają w ilu litrach 0,5% roztworu pektyny nastąpi spadek lepkości o 85% w ciągu 5 godzin w temperaturze 20 ^oC, pod działaniem 1 kg preparatu pektynolitycznego.

Wnioski:

Ogólną aktywność pektynolityczną, wyrażoną w ^oPM, oznacza się na podstawie spadku lepkości roztworu pektyny pod działaniem preparatu pektynolitycznego. Spadek lepkości jest wynikiem sumarycznego działania kompleksu enzymów pektynolitycznych zawartych w preparacie. Mogą to być pektynoesterazy, poligalakturonazy i liazy.

Oznaczenie aktywności poligalakturonaz metodą kolorymetryczną

Wykonanie:

Próba właściwa: do 0,5 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodałam 0,5 ml odpowiednio rozcieńczonego (5000 razy) woda preparatu enzymatycznego i inkubowałam w czasie 10 minut w temperaturze 30^oC. Reakcję enzymatyczną przerwałam przez dodanie 1 ml odczynnika DNS. Następnie mieszaninę umieściłam we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut , aby zaszła reakcja uwolnionych z substratu produktów redukujących z DNS. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodałam 3 ml wody destylowanej, wymieszałam i odczytałam absorbancję na fotokolorymetrze przy

530 nm wobec próby ślepej.

Próba kontrolna: do 0,5 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodałam 1 ml odczynnika DNS i 0.5ml roztworu enzymu. Dalszy tok postępowania jest taki sam jak dla próby właściwej. Zmierzyłam absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm wobec próby ślepej.

Próba ślepa: do 0,5 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodałam 1 ml odczynnika DNS i 0,5 ml wody destylowanej. Dalej postępowałam tak jak przy przygotowywaniu próby właściwej.

Obliczenia i wyniki:

Za jednostkę poligalakturonaz przyjmuje się taką ilość enzymu, która w ciągu 1 minuty w temperaturze 30^oC uwalnia z substratu grupy redukujące w ilości równoważnej 1 μmolowi kwasu D-galakturonowego.

Aktywność poligalakturonazy wyliczyłam ze wzoru:

gdzie:

A-odczyt z krzywej wzorcowej [μg/próbę]

rozc - rozcieńczenie enzymu

t - czas reakcji enzymatycznej [min]

212 - masa 1 μmola kwasu D-galakturonowego

2-przeliczenie na 1 ml enzymu

Wnioski:

Aktywność poligalakturonazy oznacza się na podstawie ilości grup aldehydowych uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy wiązania α-1,4-glikozydowego w kwasie poligalakturonowym lub niskozmetoksylowanej pektynie.

Metoda polega na utlenieniu kwasem 3,5-dinitrosalicylowym grup redukujących w produktach uwolnionych w wyniku degradacji niskozmetoksylowanej pektyny przez poligalakturonazy.

Tabela nr 1. Zestawienie obliczonych wartości aktywności charakteryzujących preparaty pektynolityczne (pektopol i pektynaza)

Ogólna aktywność pektynolityczna		Aktywność poligalakturonazy
^oPM		μmol/g*min
Pektopol	Pektynaza	Pektopol	Pektynaza
6906	10113	2387	6724
-	-	2024	6641
10256	10113	1774	5707
9107	11812	2656	6226

Wyniki umieszczone w tabeli nr 1 wskazują, że pektopol posiada niższą ogólną aktywność pektynolityczną i aktywność poligalakturonazy w stosunku do pektynazy..

Oznaczenie aktywności pektynoesterazy (ćwiczenie pokazowe)

Wykonanie:

Próba właściwa: do zlewki o pojemności 200 ml należy wlać 50 ml roztworu pektyny

w 0,1 M NaCl ogrzanej do temperatury 30^oC. Przy pomocy0,1 M NaOH doprowadzić pH pektyny do 4. Dodać 50 ml wodnego roztworu preparatu pektynolitycznego podgrzanego do tej same temperatury. Po wymieszaniu mieszaninę inkubować na łaźni wodnej o temperaturze 30^oC w czasie 30 minut. Następnie za pomocą 0,1 M roztworu NaOH doprowadzić pH mieszaniny do 7,5, notując zużycie ługu.

Próba ślepa: należy przygotować w podobny sposób jak próbę właściwą z tą różnicą, że do roztworu pektyny należy dodać roztwór preparatu pektynolitycznego po uprzedniej inaktywacji przez ogrzanie we wrzącej łaźni wodnej w czasie 25 minut. Różnica w objętościach 0,1 M NaOH, zużytych na odmiareczkowanie próby właściwej i ślepej, odpowiadailości ługu potrzebnego do związania uwolnionych w czasie reakcji grup karboksylowych.

Obliczenia i wyniki:

Aktywność pektynoesterazy wyraża się jako ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, zhydrolizowanych przez 1g (lub 1ml) preparatu pektynolitycznego, w czasie 1 minuty, w temperaturze 30^oC, w obecności 0,1 M NaCl.

Do obliczeń stosuje wzór:

gdzie:

V, V_o-ilość ml 0,1 M NaOH, zużytych na miareczkowanie grup karboksylowych,

uwalnianych w próbach,

100-ilość mikrorównoważników wiązań estrowych, odpowiadająca 1 ml 0,1 M NaOH,

t-czas hydrolizy (min),

v-ilość preparatu pektynolitycznego (ml).

V= 10,6 ml + 8,2 ml = 18,8 ml

V_o= 10,7 ml + 4,5 ml = 15,2 ml

Wniosek:

Aktywność pektynoesterazy została oznaczona na podstawie ilości grup karboksylowych uwolnionych w wyniku enzymatycznej hydrolizy wiązania estrowego w pektynie

6

---