kryteria wyboru metody izolacji DNA- rodzaj organizmu z którego zamierzamy izolować DNA np. zwięrzęta, rośliny, bakterie, wirusy, - typ organelli komórkowych z których ma być izolowane DNA np. jądro komórkowe, mitochondrium, chloroplasty, itp., - przeznaczenie izolowanego DNA, czyli jaka ilość i jakość wyizolowanego DNA jest konieczna do dalszych eksperymentów.etapy izolacji DNA- fizyczne zanieczyszczenia struktury tkankowej i komórkowej materiału biologicznego tzw. homogenizacja, - uwolnienie DNA, - usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych, - oddzielenie DNA od związków użytych na wcześniejszych etapach izolacji, czyli detergentów, soli, inhibitorów, - przygotowanie DNA do przechowywania. DNA jest przechowywane w postaci roztworu wodnego lub buforach typu TE.koncentracjA DNA za pomocą metody spektrofotometrycznej - pomiar stężenia DNA poprzez pomiar widma absorbcji przy długości fali λ = 260 nm określanej jako gęstość optyczna, tzn. ilość DNA w analizowanych próbkach jest porównywana do standardowych stężeń gdzie wyznacznikiem jest fluorescencja w świetle UV emitowana przez dodany barwnik fluorescencyjny np. bromek etydyny.PCR polega na amplifikacji in vitro określonych, bądź przypadkowych, fragmentów DNA, czyli powielanie fragmentu DNA na matrycy kwasu nukleinowego z użyciem starterów i termostabilnej polimerazy. Starterami są oligonukleotydy wyznaczające miejsca rozpoczęcia syntezy komplementarnych nici DNA, jako starterów używa się syntetycznych jednoniciowych fragmentów DNA (dł. ok.10- 30 p.z. - zależnie od prowadzonej reakcji). Miejsce przyłączenia starterów wyznacza amplifikowany obszar; PCR składa się zazwyczaj z 25 do 40 cykli. Jeden cykl stanowią następujące po sobie reakcje: a)denaturacji DNA, b) hybrydyzacji starterów c) syntezy komplementarnych nici PCR umożliwia zwielokrotnienie w tysiącach kopii wybranego odcinka DNA poprzez rozdzielenie podwójnej helisy DNA i dobudowywanie nici komplementarnej przy udziale polimerazy. Powielanie odcinków DNA, w których zyskuje się jego identyczne kopie można przeprowadzić poprzez klonowanie DNA in vivo - polega na wprowadzeniu genu wyselekcjonowanego do komórki żywej, która przez swój podział powoduje zwiększenie ilości komórek potomnych i tym samym - genu, który został do niego wprowadzony. PCR przeprowadza sie w tzw. termocyklerze, który służy do sterowania temperaturą.etapy PCR I. Denaturacja - rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA w wysokiej temperaturze (ok.90 °C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95°.II. Hybrydyzacja odcinków starterowych (annealing) - tworzenie odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-60 °C), przyłączają się one do matrycy. III. Elongacja - zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 °C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Następnie cykl powtarza się i w kolejnym etapie annealingu i elongacji. Powtarzanie cykli powoduje powielanie czasteczki DNA w postępie geometrycznym (2n) : 2 - liczba nici, n - liczba cykli. zasady projektowania starterów 1. Długość 18-20 nt 2. równa proporcja par nukleotydów A+T=C+G (po 50%±10%) 3. Zbliżona temperatura topnienia obu starterów (Tm=4(A+T)+2(C+G)) 4. Brak sekwencji powtórzonych 5. Brak możliwości utworzenia struktury spinki 6. Brak możliwości łączenia się starterów ze sobą
marker PCR - wskaźnik, który dostarcza informacji o potencjale genetycznym danego osobnika - prążek o ściśle zdefiniowanej wielkości, otrzymywany poprzez trawienie jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi, amplifikację (PCR) lub też połączenie tych dwóch technik, marker taki powinien dziedziczyć się w następnych pokoleniach i powinien być połączony (sprzężony) z badaną cechą selekcyjną.marker kodominujący to taki, dla którego można określić pełny genotyp osobnika - np. rozróżnić homozygotę od heterozygotymarker dominujący to taki w którym występowanie jednego allelu maskuje inne.Temperatura topnienia to temp., w której 50% dwuniciowych cząsteczek DNA ulega rozpleceniu. Wiązania wodorowe między resztami zasad azotowych zostają zerwane. W łańcuchowej reakcji polimeryzacji (PCR), dopiero po rozpleceniu helisy polimeraza DNA ma możliwość związania się z jedną z nici i syntezy nici komplementarnej. Temperatura ta zależna jest od procentowej zawartości par GC względem par AT. Im więcej par GC tym temperatura wyższa. Jest to spowodowane tym, iż pary GC są połączone trzema wiązaniami wodorowymi a pary AT tylko dwoma. Tm=4(A+T)+2(C+G) Elektroforeza jest metodą rozdzielania w polu elektrycznym cząsteczek różniących się wielkością i ładunkiem elektrycznym. DNA obdarzony jest ładunkiem ujemnym, toteż w polu elektrycznym migruje w kierunku bieguna dodatniego. Ponieważ stosunek ładunku elektrycznego do masy cząsteczki jest w DNA stały, cząsteczki będą rozdzielały się pod względem masy. długość rozdzielanych cząstek DNA W wyniku trawienia danej cząsteczki DNA przez określony enzym restrykcyjny powstaje zawsze taka sama liczba fragmentów określonej wielkości. Liczbę i wielkość uzyskiwanych fragmentów DNA ustala się poddając strawiony DNA elektroforezie w żelach agarozowych lub akryloamidowych. Analizując produkty trawienia różnymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo, w kombinacjach, oraz w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu - można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy w obrębie badanej cząsteczki DNA.Tempo migracji cząsteczek DNA w polu elektrycznym zależy od: - wielkości i kształtu cząsteczki DNA, posiadanego ładunku i masy cząsteczkowej, - konformacji DNA ,- ośrodka w którym następuje rozdział - w żelu do elektroferezy ( np. żel poliakryloamidowy, agarozowy), -natężenia pola elektrycznego: przy niskim natężeniu pola, migracja fragmentów liniowych DNA jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. Jednakże przy wzroście natężenia pola elektrycznego ruchliwość fragmentów DNA o dużej masie cząsteczkowej nie wzrasta w sposób proporcjonalny. Dlatego efektywny zakres rozdziału w żelu agarozowym zmniejsza się ze wzrostem napięcia.-składu buforu do elektroforezy: ruchliwość elektroforetyczna DNA jest zależna od składu i siły jonowej buforu, w którym przeprowadzamy elektroforezę. Niska siła jonowa buforu powoduje szybszą migrację rozdzielanych białek, a wysoka wolniejszą, mobilność jonów znajdujących się w buforze zależy w od tego jakiej wielkości są molekuły jonów. Większe poruszają się wolniej. izoschizomery enzymy restrykcyjne izolowane z odrębnych organizmów rozpoznają takie same sekwencje DNA i tną daną sekwencję w identycznym miejscu Zwykle pierwszy poznany enzym rozpoznający i trawiący daną sekwencję jest prototypem rodziny, a każdy następny uważany jest za jego izoschizomer. neoschizomery rozpoznają tę sama sekwencję co tzw. prototyp (enzym restrykcyjny o określonych parametrach cięcia, wyizolowany jako pierwszy), jednak tnie ją w różnych miejscach. Neoschizomery zaliczane są do specyficznego podtypu izoschizomerów.
DZIAŁANIE i WYKORZYSTANIE - ENZYMY RESTRYKCYJNE z grupy endonukleaz, rozpoznają i przecinają dwuniciową cząsteczkę DNA w obrębie ściśle określonej sekwencji nukleotydów specyficznych dla danego enzymu restrykcyjnego. Występują w komórkach bakteryjnych, gdzie służą do niszczenia obcego DNA, np. bakteriofagowego. W inżynierii genetycznej wykorzystuje się enzymy restrykcyjne do cięcia nici DNA. Określone fragmenty DNA otrzymane z dowolnego organizmu w wyniku cięcia enzymami restrykcyjnymi włącza się do niewielkich cząstek DNA mających zdolność autonomicznej replikacji (np. plazmidów lub wirusów). Spełniają one rolę przenośników czyli wektorów, które po wprowadzeniu do komórki gospodarza, np. bakterii, umożliwiają namnażanie się w niej obcych genów i przekazywanie ich komórkom potomnym. Technika ta stwarza możliwość łączenia ze sobą różnych genów, które w komórkach biorcy stanowią matrycę dla syntezy RNA i białek. Pozwala to na dokładne poznanie funkcji ściśle określonych fragmentów DNA i umożliwia produkcję pożądanych białek przez organizmy, które w naturze nie są do tego zdolne. Enzymy te różnią się między innymi długością rozpoznawanego fragmentu DNA i rodzajem wytwarzanych po przecięciu cząsteczki końców.trawienie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych i elektroforezę zależy od aktywności enzymu i ilości DNA przeznaczonego do trawienia.??????? Znając sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny, oraz skład nukleotydowy DNA (proporcje par zasad GC do AT) można obliczyć ile prawdopodobnie miejsc restrykcyjnych znajduje się w obrębie genomu danego organizmu.Mapa restrykcyjna - wskazuje miejsca cięte przez enzymy restrykcyjne, rozmieszczenie w DNA miejsc rozpoznawanych przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w liczbie nukleotydów. W celu utworzenia takiej mapy przeprowadza się trawienie DNA przy użyciu różnych restryktaz. Analiza produktów trawienia DNA rozdzielonych elektroforetycznie na żelu umożliwia ustalenie położenia oraz odległości pomiędzy sekwencjami wrażliwymi na działanie zastosowanych enzymów. klonowanie tworzenie jednakowych pod względem genetycznym osobników., polega na wprowadzeniu do komórek biorcy ściśle określonego odcinka DNA dawcy zawierającego jeden lub kilka genów w celu zmienienia właściwości biorcy. W efekcie otrzymuje się klony, czyli zbiór identycznych organizmów. DNA przeznaczony do klonowania może być wyizolowany z komórek dawcy lub zsyntetyzowany chemicznie (PCR).wektor nośniki (cząsteczki DNA, wirus, plazmid lub sztuczny chromosom,) służące do wprowadzania fragmentów obcego DNA do komórki gospodarza,stosowane są między innymi w:• klonowaniu i amplifikacji sekwencji DNA• badaniu mechanizmów ekspresji sekwencji DNA• wprowadzaniu genów do komórek bakteryjnych lub organizmów wyższychrekombinowanie proces wymiany materiału genetycznego, w wyniku którego powstają nowe genotypy. połączenie dwóch różnych cząsteczek DNA z dwóch różnych organizmówrestryktazy - (enzymy restrykcyjne, endonukleazy restrykcyjne) to wyizolowane z bakterii enzymy, które rozpoznają specyficzne sekwencje na nici DNA (zazwyczaj są to sekwencje palindromowe), a następnie przecinają dwuniciową cząsteczkę DNA w ściśle określonym miejscu. Ligazy DNA enzymy katalizujące tworzenie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcem 3` a końcem 5' zawierającym resztę fosforową w DNA, umożliwiają wypełnianie przerw powstałych na jednej nici dwuniciowego DNA oraz łączenie fragmentów DNA posiadających homologiczne lepkie lub tępe końce. Najczęściej wykorzystywane są dwa enzymy: ligaza DNA z E. coli i ligaza DNA z faga T4.