Analiza bakteriologiczna gleby
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Przygotować rozcieńczenia: do kolby z 900 cm3 jałowej wody buforowanej zespół I wsypuje 100 g gleby ogrodowej a II zespół 100 g gleby piaszczystej. W ten sposób uzyskujemy rozcieńczenie 10-1. Całość wytrząsamy przez 15 minut. Z rozcieńczenia 10-1 przenosimy 10 cm3 do kolbki z 90 cm3 jałowej wody buforowanej, uzyskujemy rozcieńczenia 10-2, dokładnie mieszamy. Czynności powtarzamy aż uzyskamy rozcieńczenie 10-6.
Z każdego rozcieńczenia, po bardzo dokładnym wymieszaniu, pobrać po 4 cm3 zawiesiny i przenieść do pustych, sterylnych probówek. W celu wyeliminowania mikroflory niesporowej wszystkie probówki należy ogrzać w łaźni wodnej w temp. 800C w ciągu 15 minut.
Oznaczanie ogólnej liczby bakterii. Dla gleby piaszczystej z kolbek z rozcieńczeniami: 10-1, 10-2, 10-3, dla gleby ogrodowej z kolbek z rozcieńczeniami: 10-4, 10-5, 10-6, pobrać po 1 cm3 zawiesiny wylać na sterylne płytki Petriego i zalać agarem odżywczym. Wymieszać, pozostawić do zastygnięcia. Inkubacja temp. 280C przez 48 godz.
Oznaczanie liczby bakterii termofilnych. Dla gleby piaszczystej z kolbek z rozcieńczeniami: 10-1, 10-2, 10-3, dla gleby ogrodowej z kolbek z rozcieńczeniami: 10-4, 10-5, 10-6, pobrać po 1 cm3 zawiesiny wylać na sterylne płytki Petriego i zalać agarem odżywczym 3%. Wymieszać, pozostawić do zastygnięcia. Inkubacja temp. 550C przez 24 godz.
Oznaczanie liczby bakterii sporowych. Dla gleby piaszczystej z probówek, które były ogrzewane w łaźni, z rozcieńczeniami: 10-1, 10-2, 10-3, dla gleby ogrodowej z probówek, które były ogrzewane w łaźni, z rozcieńczeniami: 10-4, 10-5, 10-6, pobrać po 1 cm3 zawiesiny wylać na sterylne płytki Petriego i zalać agarem odżywczym. Wymieszać, pozostawić do zastygnięcia. Inkubacja temp. 280C przez 48 godz.
Podawanie wyników.
Wynik oznaczeń podać jako ogólną liczbę bakterii, liczbę bakterii termofilnych oraz liczbę bakterii sporowych w 1 g sm. Podać także procentową zawartość bakterii sporowych w stosunku do ogólnej liczby bakterii.
Oznaczenie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową.
I - Badanie wstępne. Należy wykonać posiewy zawiesiny z rozcieńczeń z kolbek w następujący sposób. Dla obu rodzajów gleby posiać 10 cm3 próbki z rozcieńczenia 10-1 do kolbki z podłożem Kesslera o podwójnym stężeniu. Następnie po 1 cm3 z kolbek ze wszystkich rozcieńczeń do odpowiednio oznakowanych probówek z 9 cm3 podłoża Kesslera o normalnym stężeniu i rurką Durhama. Zaszczepione podłoża inkubować w temp. 370C przez 24 godz. Po okresie inkubacji wykonać obserwacje wzrostu bakterii. Hodowle w których nie stwierdzono gazu i zmętnienia podłoża pozostawić w cieplarce na dalsze 24 godz. Jeśli po 48 godz. w hodowli nie stwierdzi się obecności gazu i zmętnienia, wynik oznaczenia należy uznać za negatywny i badanie należy zakończyć na tym etapie.
W przypadku stwierdzenia po 24 i 48 godz. inkubacji obecności gazu i zmętnienia podłoża należy przystąpić do drugiego etapu badań.
II - Badania potwierdzające. Z hodowli wskazującej na wzrost bakterii grupy coli przeszczepić próbę, metodą posiewu powierzchniowego na podłoże Endo i inkubować w temp. 370C w ciągu 24 godz. Za wynik dodatni oznaczenia uznać należy obecność typowych kolonii ciemnoczerwonych z metalicznym połyskiem. Kolonie gładkie o jasno lub ciemno różowym zabarwieniu z ciemniejszym środkiem bez charakterystycznego połysku uznawane są za tzw. kolonie nietypowe. Obecność tych kolonii wymaga przeprowadzenia dalszego badania uzupełniającego. Wzrost innych kolonii należy uznać jako wynik ujemny.
III - Badania uzupełniające. Badanie to polega na określeniu zdolności wyizolowanego szczepu do fermentacji laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu (tzw. wtórna fermentacja laktozy) oraz wykonania obserwacji mikroskopowych (w tzw. kropli wiszącej i barwienie metodą Grama) i testu na wytwarzanie oksydazy cytochromowej.
Dla przeprowadzenia powyższych badań materiał pobrany z kolonii należy przesiać na podłoże laktozowe ze wskaźnikiem Andrade oraz rurką Durhama oraz na powierzchnię skosu z agarem odżywczym. Inkubacja 370C przez 24 godz. Po inkubacji prowadzić obserwacje.
Zdolność fermentacji laktozy stwierdzić można na podstawie zakwaszenia - wystąpienie różowego zabarwienia oraz obecność gazu w podłożu laktozowym ze wskaźnikiem Andrade i rurką Durhama. Brak tych zmian przyjmuje się za wynik ujemny.
Obserwacja mikroskopowa - za wynik dodatni przyjmuje się:
- obecność drobnych różowo zabarwionych pałeczek w preparacie barwionym metodą Grama;
- obecność ruchliwych pałeczek Gram (-) w kropli wiszącej.
Test na obecność oksydazy cytochromowej wykonuje się przy użyciu hodowli bakterii na skosie agarowym. W tym celu na powierzchnię 24 godz. hodowli badanego szczepu nanieść kilka kropli odczynnika z α-naftolem i chlorowodorkiem paraaminodwumetyloaniliny. Wystąpienie w czasie od 30 sekund do 2 minut intensywnego niebieskiego zabarwienia po dodaniu odczynnika spowodowane jest powstaniem błękitu indofenolowego w obecności tlenu, cytochromu c i oksydazy cytochromowej. Zabarwienie o słabej intensywności lub występujące później niż po 2 minutach należy zinterpretować jako brak obecności oksydazy cytochromowej. Stwierdzenie występowania oksydazy cytochromowej w hodowli wyklucza obecność bakterii grupy coli.
Oznaczenie bakterii coli typu kałowego (Escherichia coli) metodą fermentacyjną probówkową. Materiał ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli z badania wstępnego przy oznaczaniu bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową, przenieść na podłoże płynne z zielenią brylantową i rurką Durhama oraz na wodę peptonową z tryptofanem do wykrywania indolu. Po inkubacji za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach, zmętnienie podłoża z zielenią brylantową. Wytworzenie indolu sprawdzić tylko w przypadku dodatniego wyniku na podłożu z zielenią brylantową.
Oznaczanie miana Clostridium perfringens. Dla gleby piaszczystej z probówek, które były ogrzewane w łaźni, z rozcieńczeniami: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dla gleby ogrodowej z probówek, które były ogrzewane w łaźni, z rozcieńczeniami: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, pobrać po 1 cm3 zawiesiny wylać na sterylne płytki Petriego i zalać podłożem siarczynowo-żelazowym wg Wilson-Blaira. Wymieszać, pozostawić do zastygnięcia. Inkubacja temp. 370C przez 18-24 godz. Pojawienie się w ciągu pierwszych 18 godz. inkubacji w głębi agaru czarnych kolonii często rozrywających podłoże na skutek wytwarzania gazu świadczy o obecności Clostriduim perfringens. Czarne zabarwienie kolonii powstaje w wyniku redukcji siarczynu sodu do siarczku sodu (Na2S), który z chlorkiem żelaza tworzy czarno zabarwiony siarczek żelaza.
Oznaczanie miana bakterii gnilnych - Proteus vulgaris. Z każdego rozcieńczenia gleby (obu rodzajów) pobrać 1 cm3 zawiesiny z kolbek i wprowadzić ostrożnie do wody kondensacyjnej świeżo przygotowanych skosów agarowych (nie dotykając powierzchni skosu). Zaszczepione podłoże inkubować w temp. 370C przez 24 godz. Po okresie inkubacji wykonać obserwacje wzrostu wyrosłych bakterii. Obecność Proteus vulgaris stwierdzić na podstawie wystąpienia wzrostu pełzającego oraz charakterystycznych właściwości morfologicznych (Gram (-) bardzo ruchliwe pałeczki).
- 3 - Analiza bakteriologiczna gleby