Enzymy  5. 1. Aktywność a parametry środowiska Ogólna aktywność enzymów, podobnie jak wszystkich białek, jest zależna od parametrów fizykochemicznych środowiska: temperatury,pH, siły jonowej i innych. Maksimum aktywności enzymu leży w pewnym optymalnym zakresie danego parametru środowiskowego. W zależności od enzymu, położenie optimum może być różne, a jego zakres szerszy lub węższy. Także ogólny kształt wykresu zależności aktywności danego enzymu od parametru środowiska jest różny dla różnych enzymów, w zależności od ich pochodzenia, budowy itp. Dla czynników środowiska bezpośrednio wpływających na strukturę drugorzędowa białka (i wyższe organizacje struktury), jak temperatura czy pH, charakterystyczny jest gwałtowny spadek aktywności enzymów poza optimum (lub po przekroczeniu go, w przypadku temperatury), związany z denaturacją enzymów. W zależności od enzymu, taka denaturacja może być odwracalna lub nie. Parametry środowiska mogą stanowić podstawę kontroli aktywności enzymów (patrz: Kontrola aktywności)^[72]. 5. 1. 1. Temperatura Zależność aktywności enzymów od temperatury. Gwałtowny spadek aktywności po przekroczeniu temperatury optymalnej związany jest z denaturacją struktury enzymów Szybkość reakcji enzymatycznych wzrasta wraz ze wzrostem temperatury. Wiąże się to ze wzrostem energii kinetycznej cząstek i większą częstotliwością ich zderzeń. Wzrost aktywności enzymatycznej w zależności od temperatury opisuje współczynnik temperaturowy Q10, określający jak zmienia się szybkość reakcji przy wzroście temperatury o 10 °C: Wpływ temperatury na aktywność enzymów nie jest prostą zależnością. Aktywność rośnie wraz ze wzrostem temperatury, jednakże tylko w takim zakresie temperatury, w którym enzym pozostaje stabilny. Po przekroczeniu temperatury krytycznej, następuje denaturacja termiczna enzymów, w wyniku czego aktywność gwałtownie spada. Przeciętnie szybkość reakcji enzymatycznych wzrasta dwukrotnie przy wzroście o każde 10 °C w zakresie temperatur niedenaturujących struktury enzymu (Q10=2). Zatem także parametr Q10 ma zastosowanie tylko w niedenaturującym zakresie temperatur i jest on charakterystyczny dla danego enzymu, i zależny od energii aktywacji katalizowanej reakcji. W temperaturze optymalnej aktywność enzymu jest największa. Obserwowana temperatura optymalna jest wypadkową dwóch procesów: wzrostu szybkości reakcji związanego ze wzrostem energii kinetycznej oraz wzrostu szybkości denaturacji termicznej enzymu powyżej krytycznej temperatury. Gdy drugi składnik zaczyna przeważać, następuje spadek aktywności. Większość enzymów ma optimum temperaturowe w zakresie 30-45 °C i nieodwracalnie denaturuje oraz traci aktywność w temperaturach wyższych niż 60 °C. Jednak w przypadku organizmów termofilnych (np. bakterii ze źródeł termalnych) ich enzymy zachowują aktywność i osiągają maksymalną szybkość w podwyższonych temperaturach. Większość enzymów ulega powolnej denaturacji nawet w temperaturach optymalnych i niższych niż krytyczna. Zależy to od natury samego enzymu, stopnia jego oczyszczenia (w preparatach), a także od pH, siły jonowej i pozostałych parametrów. Najwyższa temperatura, w której jeszcze nie zachodzi termiczna dezaktywacja enzymu w danych warunkach określa tak zwaną termostabilność enzymu^[68]. 5. 1. 2. pH Większość enzymów ma także swoje optymalne pH działania. Optimum pH, obok optimum temperaturowego, to drugi najważniejszy parametr środowiska charakteryzujący aktywność enzymów. Wpływ pH na aktywność enzymów wiąże się z faktem, że enzymy jako białka posiadają wiele aminokwasów ulegających jonizacji, a aminokwasy centrum aktywnego często mogą pełnić swoją rolę tylko w określonym stanie jonizacji. Ponadto, na aktywność enzymów, wpływ ma także jonizacja samych substratów oraz kompleksów ES. Również oddziaływania enzym-substrat mogą mieć charakter jonowy, zależny od jonizacji. Przykładem takiego zjawiska jest proces hydrolizy przeprowadzany przez pepsynę. Punkt izoelektryczny (pI) tego enzymu wynosi 1, natomiast optimum jego działania to około 2,0-2,5. W tym odczynie cząsteczka pepsyny, bogata w aminokwasy dikarboksylowe, jest jeszcze ujemnie naładowanym anionem, podczas gdy większość białek ma już przy tym pH ładunek dodatni. Od stopnia jonizacji pewnych grup zależy także ogólna konformacja cząsteczki enzymu, zapewniająca mu pełną aktywność, a w za kwaśnym czy zbyt zasadowym środowisku enzym ulegnie denaturacji. Wykres zależności aktywności enzymu od pH ma najczęściej kształt dzwonowaty, czyli enzym ma największą aktywność w swoim optymalnym pH i aktywność ta spada wraz z oddalaniem się od tego punktu (np. trypsyna). Niektóre jednak enzymy mają właściwie stała aktywność w szerokim zakresie pH (np. papaina) lub są wrażliwe tylko na niskie pH, zachowując aktywność w wysokim (jak esteraza cholinowa) lub na odwrót. Zależność aktywności od pH bada się w stałej temperaturze przy maksymalnym wysyceniu enzymu substratem^[68]. 6. Inhibicja Inhibitor kompetycyjny wiąże się odwracalnie z miejscem aktywnym enzymu, zapobiegając wiązaniu substratu. Dzięki rywalizacji substratu i inhibitora o miejsce aktywne, możliwa jest kontrola prędkości zachodzącej reakcji. W inhibicji niekompetycyjnej inhibitor nie konkuruje z substratem o miejsce aktywne lecz wiąże się w innym miejscu, doprowadzając do powstania nieaktywnego kompleksu Typy inhibicji (wg W.W. Cleland^[73]) Kwas foliowy będący koenzymem (po lewej) oraz lek przeciwnowotworowy metotreksat (po prawej) mają bardzo podobną strukturę. W rezultacie metotreksat jest inhibitorem kompetycyjnym dla wielu enzymów używających folianów Aktywność wielu enzymów może być hamowana przez różne typy inhibitorów. Inhibicja taka może być odwracalna lub nieodwracalna. Ostatnia ma miejsce wtedy, gdy cząsteczki inhibitora wiążą się z enzymem trwale (np. kowalencyjnie), co doprowadza do sytuacji zablokowania aktywności danej cząsteczki enzymu na stałe^[58]. 6. 1. Typy inhibicji 6. 1. 1. Inhibicja kompetycyjna W inhibicji kompetycyjnej inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne cząsteczki enzymu. Związanie przez enzym cząsteczki inhibitora uniemożliwia zatem związanie substratów (i vice versa) i kompleks enzym-inhibitor (EI) jest enzymatycznie nieaktywny. Zazwyczaj inhibitor kompetycyjny jest strukturalnie bardzo podobny (lub ma podobny motyw bezpośrednio wiążący się do centrum aktywnego) do prawdziwego substratu dla określonego enzymu. Na przykład metotreksat jest inhibitorem kompetycyjnym dla enzymureduktazy dihydrofolianu, który katalizuje redukcję dihydrofolianu do tetrahydrofolianu i obie substancje są strukturalnie bardzo zbliżone. Przyłączenie inhibitora uniemożliwia związanie substratu i odwrotnie, dzięki czemu poprzez regulację stężenia inhibitora możliwa jest kontrola szybkości reakcji. Stałą dysocjacji inhibitora kompetycyjnego można opisać równaniem^[52][58]: W inhibicji kompetycyjnej maksymalna szybkość reakcji (Vmax) nie zmienia się i może być osiągnięta poprzez zwiększenie stężenia substratów, które przezwycięży inhibicję. Zmianie natomiast ulega pozorna wartość Km, nowa wartość Km, zwana Km^app (pozorna stała Michaelisa) jest równa^[58]: gdzie: [I] - stężenie inhibitora, Ki - stała dysocjacji dla kompleksu enzym-inhibitor Zatem wzrost [I] pociąga za sobą wzrost Km^app. 6. 1. 2. Inhibicja akompetycyjna W inhibicji akompetycyjnej inhibitor nie może się wiązać do wolnego enzymu, a jedynie do kompleksu enzym-substrat (ES), tworząc kompleks enzym-inhibitor-substrat (EIS). Ponieważ w takiej sytuacji zmniejszone jest stężenie kompleksu ES, zwiększa to pozorne powinowactwo enzymu do substratu, zatem wartość Km jest mniejsza. Utworzony kompleks EIS jest enzymatycznie nieaktywny i reakcja nie może być kontynuowana, dopóki miejsce aktywne enzymu nie zostanie zwolnione, co obniża Vmax w porównaniu do reakcji nieinhibowanej^[74]. Ten typ inhibicji jest dość rzadki i może dotyczyć niektórych enzymów multimerycznych (wielopodjednostkowych). 6. 1. 3. Inhibicja niekompetycyjna Inhibitory niekompetycyjne mogą się wiązać do wolnego enzymu, jednak nigdy do jego miejsca aktywnego, wobec tego nie konkurują z substratami, które także mogą się przyłączyć do powstałego kompleksu. Oba możliwe kompleksy, enzym-inhibitor (EI) i enzym-inhibitor-substrat (EIS) są enzymatycznie nieaktywne. Ponieważ wiązanie inhibitora jest całkowicie niezależne od substratu, co oznacza, że większe stężenie substratu nie wpływa na obniżenie oddziaływań z inhibitorem (w przeciwieństwie do inhibicji kompetycyjnej), zatem zmienia się tylko wartość Vmax a wartość Km pozostaje stała^[52][58]. 6. 1. 4. Inhibicja mieszana Ten typ inhibicji przypomina inhibicję niekompetycyjną, z wyjątkiem występowania dodatkowo kompleksu enzym-inhibitor-substrat (EIS), mającego znikomą aktywność enzymatyczną. W inhibicji mieszanej obie wartości opisujące reakcję enzymatyczną: Km i Vmax, zmieniają się^[58]. 6. 2. Inhibicja nieodwracalna Inhibitory nieodwracalne reagują z enzymem, wiążąc się kowalencyjnie, a zatem nieodwracalnie, do jego łańcuchów białkowych. Taka inhibicja trwale unieczynnia daną cząsteczkę enzymu. Do inhibitorów tego typu należy eflornityna, lek stosowany w pasożytniczej chorobie - śpiączce afrykańskiej^[75]. Również penicylina i aspiryna mają podobny mechanizm działania. Inhibitory te wstępnie, jeszcze nie kowalencyjnie, wiążą się z miejscami aktywnymi enzymów, po czym dopiero aktywność enzymu przekształca je w reaktywne formy, które wiążą się nieodwracalnie z jedną lub więcej resztami aminokwasowymi miejsca aktywnego enzymu, blokując je^[52][58]. 6. 3. Regulacja aktywności enzymów przez inhibitory W wielu reakcjach inhibitory biorą udział w mechanizmie regulacji aktywności enzymatycznej na drodze sprzężenia zwrotnego. Jeśli enzym produkuje jedną substancję ponad potrzeby komórki, to ta substancja może stać się inhibitorem dla tego enzymu, co zmniejsza lub całkowicie hamuje aktywność enzymu, co z kolei zmniejsza stężenie produktu. Taka regulacja jest formą ujemnego sprzężenia zwrotnego. Enzymy, które poddane są tego typu regulacji, to często układy wielopodjednostkowe, posiadające kilka miejsc aktywnych dla substancji regulatorowych. Dla takich enzymów, wykres prędkości katalizowanej reakcji w zależności od stężenia substratu, nie ma przebiegu hiperbolicznego, ale sigmoidalny (kształt litery S)^[53][76]. 7. Kontrola aktywności Istnieje kilka głównych sposobów kontroli aktywności enzymów w układach biologicznych: Sama produkcja enzymu na etapach translacji, jak i wcześniejszej transkrypcji, podlega ścisłej kontroli i może być zwiększana (uruchamiana) lub zmniejszana (zatrzymana) przez komórkę w odpowiedzi na zmiany w środowisku zewnętrznym komórki, tak samo jak kontrolowana jest w ten sposób produkcja każdego innego białka. Sortowanie i rozdzielanie enzymów do docelowych kompartmentów (także poza komórkę) i utrzymywanie ich tam, jest sposobem na kontrolę ich aktywności w przestrzeni. Enzymy działają wtedy na szlakach metabolicznych umiejscowionych w różnych przedziałach komórkowych, nie interferują z innymi szlakami, a ich aktywność może być także szybko zmieniona poprzez globalną zmianę charakterystyki środowiska kompartmentu w którym się znajdują (np. obniżenie pH w lizosomie). Różne kompleksy enzymatyczne zawarte w różnych przedziałach komórkowych, a co za tym idzie podział syntezy na etapy, jak również oddzielenie syntezy od rozkładu, umożliwia dokładną kontrolę szlaku metabolicznego na każdym etapie przez różne czynniki^[77]. Aktywność enzymów może być regulowana przez specjalne cząsteczki - inhibitory (patrz: Inhibicja) i aktywatory. Jest to najbardziej bezpośredni sposób modulacji ich aktywności. Enzymy mogą być regulowane poprzez ich modyfikacje potranslacyjne. Modyfikacje takie mogą obejmować kowalencyjne zmiany struktury cząsteczki, np. dodawanie dodatkowych grup funkcyjnych: fosforylacja, mirystylacja czy glikozylacja. Przykładowo związanie insuliny z odpowiednim receptorem uwalnia kaskadę fosforylacji wielu enzymów i w rezultacie syntezę glikogenu^[78]. Innym przykładem potranslacyjnych modyfikacji enzymów jest modyfikacja łańcucha polipeptydowego enzymu poprzez jego skracanie, przycinanie. Przykładowo chymotrypsyna, proteolityczny enzym trawienny, jest produkowany w trzustce i wydzielany do światładwunastnicy w formie nieaktywnej, jako chymotrypsynogen. Tam następuje jego aktywacja poprzez skrócenie łańcucha polipeptydowego i uwolnienie aktywnej cząsteczki dojrzałego enzymu. Produkcja enzymu w formie proenzymu zabezpiecza trzustkę i inne tkanki, zanim dotrze do jelita, przed strawieniem^[79]. Nieaktywny prekursor enzymu nazywany jest proenzymem (dawniej zymogenem). Gdy aktywacja enzymu jest wieloetapowa, mówi się wtedy o preproenzymach^[80]. Przycinanie proenzymu do formy aktywnej zachodzi z udziałem innych enzymów lub czasami sam enzym jest w stanie katalizować reakcję aktywacji swoich form proenzymatycznych^[81]. Niektóre enzymy mogą stać się aktywne (nieaktywne), gdy znajdą się w innym środowisku, np. po przeniesieniu ze środowiska cytoplazmy o właściwościach redukujących do środowiska przestrzeni peryplazmatycznej o właściwościach utleniających, z wysokiego pH do niskiego pH, itp. Przykładem może być hemaglutynina - glikoproteina o właściwościach antygenowych - na powierzchni wirusów grypy, która zmienia konformację, gdy znajdzie się w kwaśnym środowisku pęcherzyka komórkowego gospodarza, powodując aktywację wirusa^[82].

---