Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie nr 1

AMINOKWASY

Magdalena Dudek

Paulina Ziółczyk

Data wykonania ćwiczenia:

09.10.2008

Data oddania sprawozdania

16.10.2008

Cel ćwiczenia:

Celem naszego ćwiczenia na laboratorium było za pomocą doświadczeń udowodnienie amfoterycznego charakteru aminokwasów oraz poznanie ogólnych oraz wybiórczych metod ich analizy.

Wstęp teoretyczny:

Aminokwasy- związki chemiczne zawierające dwie grupy funkcyjne: aminową
i karboksylową. Aminokwasy, którymi będziemy się zajmować należą do α-aminokwasów, czyli w związkach tych, obie grupy funkcyjne połączone są z tym samym (α) atomem węgla.

Z wyjątkiem glicyny dla której łańcuch boczny (R) stanowi atom wodoru, wszystkie cztery podstawniki związane z atomem węgla α są różne. Takie tetraedyczne ułożenie czterech różnych podstawników nadaje aminokwasom właściwości optycznie czynne
(możliwość skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego).

Ogólne reakcje chemiczne jakim ulegają aminokwasy można przewidzieć znając reakcje charakterystyczne dla występujących grup funkcyjnych. Dzięki występowaniu dwóch podstawowych grup funkcyjnych aminowej i karboksylowej aminokwasy są związkami amfoterycznymi, mogą zachowywać się jak słabe kwasy lub jak słabe zasady. Możemy dzięki temu przy pomocy metod ogólnych potwierdzić czy mamy do czynienia z aminokwasem.

Natomiast jeżeli chcemy się dowiedzieć dokładnie jaki aminokwas badamy musimy skorzystać z ich szczególnych właściwości, które zależą już od łańcucha bocznego R
i od grup funkcyjnych jakie w nim występują.

Do metod ogólnych należą:

- reakcja z ninhydryną

- reakcja z kwasem azotawym (wg. Van Slyke'a)

Do metod wybiórczych:

- Dla aminokwasów aromatycznych

reakcja ksantoproteinowa

- Dla tyrozyny

reakcja Millona

- Dla tryptofanu

reakcja wg. Adamkiewicza- Hopkinsa

odczyn aldehydowy w. Rosenheima

- Dla histydyny

odczyn Pauly'ego

- Dla cysteiny

reakcja cystynowa

Zadaniem kończącym pierwsze laboratorium było wykrycie nieznanego aminokwasu
w otrzymanej probówce, dającego się wykryć wymienionymi wyżej reakcjami.

Wykonanie zadania laboratoryjnego

Zadania wstępne (wykonywane z zespołach dwuosobowych)

1. Amfoteryczne właściwości aminokwasów

Wykonanie: otrzymaną do probówki szczyptę krystalicznej L-tyrozyny rozpuściłyśmy na ciepło w kilkunastu (ok.18) kroplach roztworu HCl o stęż. 0,1M. Następnie powoli kroplami dodawałyśmy roztwór NaOH o stęż. 0,05M, aż do momentu uzyskania wyraźnego białego osadu. Tak otrzymany roztwór z osadem alkalizowałyśmy przy użyciu niewielkiej ilości mocniejszej zasady sodowej o stęż. 30%.

Obserwacje: Podczas ogrzewania substancji krystalicznej na ciepło w kwasie, substancja ta rozpuściła się. w następnej części doświadczenia wytrącił nam się biały, kłaczkowaty osad, który po dodaniu mocniejszej zasady roztworzył się.

Wnioski: Celem tego zadania było zbadanie punktu izoelektrycznego(pI) tyrozyny, który znajduje się przy pH równym 5,7. w momencie osiągnięcia tego punktu i zbliżenia się do danej wartości pH pojawił nam się biały osad, ponieważ w punkcie pI aminokwas ten jest prawie nierozpuszczalny. W środowisku o niższym lub wyższym pH (pH> pI> pH) osad tyrozyny dość szybko się rozpuszcza co potwierdza amfoteryczny charakter aminokwasów. Aminokwasy zachowują się wtedy jak słabe kwasy lub jak słabe zasady, przyjmując lub oddając proton.

2. Odczyn ninhydrynowy

Wykonanie: do 5ml badanego roztworu aminokwasu (glicyny/tyrozyny/tryptofanu/histydyny) dodawałyśmy 5ml odczynnika ninhydrynowego. Tak przygotowany roztwór ogrzewałyśmy
w łaźni wodnej przez ok. 15min. To samo wykonujemy dla wody i białka.

Obserwacje: po dodaniu odczynnika ninhydrynowego i ogrzaniu nastąpiło odbarwienie roztworu, w przypadku glicyny i histydyny na kolor ciemno niebieski, natomiast w przypadku tryptofanu i tyrozyny kolor roztworu był ciemno brązowy, brunatno brązowy.

Przykładowa reakcja na przykładzie glicyny:

Wnioski: aminokwasy pod wpływem ninhydryną ulegają utlenieniu, dekarboksylacji
a później deaminacji. Aminokwas przekształca się w aldehyd uboższy o jeden atom węgla, uwalnia się amoniak oraz CO₂. W obecności powstałego amoniaku zredukowana cząsteczka ninhydryną ulega reakcji kondensacji z utlenioną cząsteczką ninhydryną i powstaje barwny
- granatowy produkt tej reakcji. Reakcja ta należy do ogólnych reakcji pozwalających wykryć w badanym roztworze obecność aminokwasów. Wyjątkami w tej reakcji są: prolina, hydroksyprolina, cysteina i cystyna, które dają roztwór o zabarwieniu żółtym.

Jednoczesne wykonywanie powyższego ćwiczenia w próbie z wodą nie dało oczekiwanego efektu, natomiast w przypadku próby z białkiem (białkiem jaja kurzego) możemy potwierdzić, że w białkach znajdują się aminokwasy, jednak po tej reakcji nie jesteśmy
w stanie szczegółowo określić jakie.

3. Reakcja z kwasem azotawym (wg. Van Slyke'a)

Wykonanie: do probówki dodajemy po kolei: 2ml roztworu NaNO₂, 2ml CH₃COOH, mieszamy, następnie dodajemy 2,5ml roztworu naszego badanego aminokwasu (glicyny, tryptofanu). To samo wykonujemy dla białka

Obserwacje: po dodaniu badanego aminokwasu obserwujemy wydzielanie się pęcherzyków gazu, burzenie się roztworu.

Wnioski: aminokwasy pod wpływem kwasu azotawego, tworzącego się podczas dodawania dwóch pierwszych składników w probówce, ulegają deaminacji, której produktami są azot cząsteczkowy i odpowiedni hydroksykwas.

Przykładowa reakcja dla glicyny:

Reakcja dała także pozytywny wynik przy badaniu białka, także potwierdza się to, iż białka zbudowane są z aminokwasów.

4. Reakcja ksantoproteinowa

Metoda wybiórcza dla aminokwasów aromatycznych

Wykonanie: do 1ml roztworu tyrozyny dodajemy 0,5ml stęż. HNO₃ i ogrzewamy przez
ok. 30sek. we wrzącej łaźni wodnej. Później schładzamy i alkalizujemy roztwór 2-3ml roztworu NaOH o stęż. 30%. To samo wykonujemy dla glicyny i białka.

Obserwacje: w probówce w której znajdował się nasz badany aminokwas roztwór zmienił barwę na ciemno żółtą, w probówce w której było białko w roztworze wytrącił się pomarańczowy osad natomiast sam roztwór odbarwił się lekko na żółto. Glicyna natomiast nie dała oczekiwanego efektu w tej reakcji.

Wnioski : aminokwasy aromatyczne ulegają nitrowaniu, tworząc nitrowe pochodne o barwie żółtej. Kiedy reakcja zachodzi w środowisku zasadowym barwa nitrowych pochodnych aminokwasów może zmienić się do żółtopomarańczowej, skutkiem utworzenia soli.

Przykładowa reakcja z tyrozyną:

5. Reakcja Millona

Reakcja charakterystyczna dla tyrozyny

Wykonanie: do 0,5ml roztworu L- tyrozyny dodajemy taką samą ilość odczynnika Millona, później ogrzewamy we wrzącej Łaźno wodnej, aż powstanie nam barwny roztwór. Ćwiczenie wykonywaliśmy dla tyrozyny, białka i wody.

Obserwacje: po ogrzaniu roztwór odbarwił się, kolor powstałego roztworu to ciemno czerwony roztwór (brudno czerwony). Woda nie dała odczynu kolorowego, natomiast
w przypadku białka roztwór zabarwił się na różowo a na powierzchni pojawił się osad.

Wnioski: w wyniku tej reakcji powstała sól rtęciowa o brudno czerwonym zabarwieniu. Zabarwienie białka na lekko różowy kolor wskazuje na obecność w jego strukturze tyrozyny, natomiast osad pojawiający się na powierzchni jest efektem koagulacji.

Reakcja z tyrozyną:

6. Odczyn aldehydowy wg. Rosenheima

Reakcja charakterystyczna dla tryptofanu

Wykonanie: do 1ml roztworu L- tryptofanu dodajemy 3-4 krople roztworu aldehydu mrówkowego, następnie 1ml stęż. kwasu siarkowego oraz 2-4 krople nasyconego roztworu siarczanu rtęci. Całość dokładnie mieszamy. Przeprowadzamy identyczne reakcje dla białka
i wody.

Obserwacje: badany roztwór zabarwił się na fioletowo. Podobny wynik uzyskałyśmy
w próbie z białkiem, natomiast roztwór z woda nie zabarwił się.

Wnioski: tryptofan z aldehydem ulega kondensacji i tworzy barwny kompleks. Zabarwienie białka wskazuje, że znajduje się w jego strukturze cząsteczka tryptofanu.

Reakcja tryptofanu z aldehydem mrówkowym:

7. Reakcja wg. Adamkiewicza-Hopkinsa

Reakcja charakterystyczna dla tryptofanu

Wykonanie: do 1ml roztworu aminokwasu (L- tryptofanu) dodajemy 1ml roztworu kwasu glioksalowego, mieszamy i ostrożnie przelewając po ściance dodajemy 1ml stęż. Kwasu siarkowego. Wg. Tego samego przepisu postępujemy z białkiem jaja kurzego i z wodą.

Obserwacje: na granicy dwóch utworzonych faz pojawia się fioletowa „obrączka”, podobny efekt obserwujemy w probówce z białkiem, jednak kolor jest bledszy, bardziej różowy.

Wnioski: fioletowa obrączka, która pojawiła się na granicy faz jest efektem kondensacji cząsteczek tryptofanu w obecności kwasu glioksalowego. Pojawiająca się obrączka w białku wskazuje na występowanie cząstek tryptofanu w tym białku.

8. Odczyn Pauly'ego

Reakcja charakterystyczna dla histydyny

Wykonanie: do 1ml roztworu histydyny dodajemy 2ml roztworu kwasu sulfanilowego oraz 1ml roztworu azotynu sodu. Po wymieszaniu dodałyśmy 1ml roztworu wodorotlenku sodu.

Obserwacje: zanim dodałyśmy zasady sodowej roztwór miał barwę żółtą, po dodaniu NaOH zmienił barwę na ciemno czerwoną.

Wnioski: pierścień imidazolowy histydyny w środowisku zasadowym ulega reakcji sprzęgania z jonem p-sulfobenzenodiazoniowym, której produktem jest czerwona pochodna diazowa.

9. Reakcja cystynowa/cysternowa

Wykonanie: niewielką ilość krystalicznej L-cysteiny rozpuszczamy w ok. 0,5ml wody, następnie dodajemy kilka kropel roztworu octanu ołowianego oraz 1ml roztworu zasady sodowej. Następnie tak wymieszany roztwór umieszczamy na ok. pół godz. w łaźni wodnej.

Obserwacje: po upływie ok. 0,5godz. pojawił się w probówce czarno-szary osad.

Wnioski: Aminokwasy siarkowe z grupami -SH lub -S-S podczas ogrzewania w środowisku silnie alkalicznym, przekształcając się w kwas pirogronowy, uwalniają siarkę w postaci jonów

siarczkowych. Jony siarczkowe reagują z jonami ołowiu (II), dając czarny osad

PbS. Dodatkowym produktem jest amoniak. Metionina nie daje dodatniego wyniku

tej reakcji.

Zadanie końcowe

Wykrywanie nieznanego aminokwasu.

Paulina Ziółczyk:

1. próba ogólna z ninhydryną

Efektem jest żółto-pomarańczowy produkt. Wykluczam prolinę.

2. reakcja ksantoproteinowa

Otrzymałam ciemnoczerwony, „krwisty”, produkt.

Wskazuje to na aminokwas aromatyczny.

Podejrzewam tryptofan, dlatego przeprowadzam reakcje wybiórczą dla tego związku.

3. Reakcja charakterystyczna dla tryptofanu

Otrzymałam żółty produkt co wyklucza podejrzewany przeze mnie aminokwas.

4. reakcja Millona

Uzyskuję czerwony produkt, co wskazuje na obecność tyrozyny

Szukanym aminokwasem jest TYROZYNA

Magdalena Dudek:

1. Odczyn ninhydrynowy- próba ogólna

W wyniku tej reakcji otrzymuję barwny kompleks (żółto brązowy) co wskazywałoby na obecność aminokwasu aromatycznego.

2. 2- Próba ksantoproteinowa

Otrzymałam w końcowym efekcie roztwór o kolorze czerwonobrunatnym.

Potwierdziły się moje przypuszczenia co do aminokwasu aromatycznego.

Podejrzewam tyrozynę dlatego przeprowadzam reakcje Millona.

3. 3- reakcja Millona

Otrzymuje barwny roztwór barwny jednak nie jest on zgodny z oczekiwanym efektem reakcji.

W takim razie przeprowadzam reakcje charakterystyczną dla tryptofanu .

4- Reakcja wg. Rosenheima

Otrzymuje roztwór o barwie ciemnofioletowej.

Wskazuje to na obecność tryptofanu.

Szukanym aminokwasem jest TRYPTOFAN.

Wnioski dotyczące poszczególnych reakcji i ich efektów zostały przedstawione przy poszczególnych zadaniach z części wstępnej laboratorium.

WNIOSKI OGÓLNE:

Dzięki amfoterycznemu charakterowi aminokwasów możemy przy pomocy reakcji charakterystycznych dla dwóch podstawowych grup znajdujących się przy atomie węgla α określić czy w badanej próbce mamy aminokwas.

Natomiast dzięki reakcjom charakterystycznym dla grup występujących w łańcuchu bocznym R i wybiórczym metodom analizy, możemy już dokładnie określić z jakim konkretnym aminokwasem mamy do czynienia.

Białka dają pozytywne wyniki w reakcjach charakterystycznych dla przedstawionych aminokwasów, ponieważ poznaliśmy metody dla aminokwasów budujących białka (w tym białko jaja kurzego). Potwierdza to tym samym, że białka zbudowane są z jednostek podstawowych jakimi są aminokwasy.

- 7 -

---