ĆW. 1 - DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA W MEDYCYNIE
Główne kierunki analizy DNA
Genomowy DNA:
Amplifikacja DNA Amplifikacja in-vitro, PCR
Hybrydyzacja molekularna Southern Blot, Northern Blot, Dot Blot, DNA Fingerprinting
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
metoda badania oparta na zdolności tworzenia kompleksu dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów nukleinowych,
polega na wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy badanym fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną, które prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze,
w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich temperatur,
proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,
odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,
badany kwas nukleinowy może być denaturowany i unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej.
Tm (odwrotny punkt topnienia) - temperatura przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i tworzenia się w wyniku renaturyzacji
Ze statycznego punktu widzenia w tej temperaturze 50% hybryd ulega rozpadowi
Tm zależy od wielu czynników: stężenia jonów Na, liczby par G-C, długości hybrydy, stężenia formamidu lub mocznika
Tm = 2 x nA-T + 4 x nC-G
Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie kompleksów różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami:
DNA - DNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) wiąże się do komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji,
DNA - RNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) tworzy hybryd z komplementarną cząsteczką RNA,
RNA - RNA, gdy sonda (wyznakowany RNA) łączy się z komplementarna cząsteczką RNA.
Stabilność wyżej wymienionych hybrydów jest zróżnicowana:
RNA -RNA > DNA -RNA > DNA -DNA
Sondy molekularne
W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi molekularne np. klonowanie lub sondy syntetyzowane chemicznie (zwykle o długości 10 - 50 nukleotydów).
Zalety sond syntetycznych:
stosunkowo łatwa dostępność,
możliwość dowolnego programowania sekwencji sond,
nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,
krótki czas hybrydyzacji,
wysoka selektywność.
Znakowanie sond molekularnych
Znakowanie najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie radioizotopu 32P w miejsce niepromieniotwórczych atomów fosforu.
Można tego dokonać poprzez:
przeniesienie z udziałem kinazy polinukleotydowej reszty fosfonowej [γ 32P] ze znakowanego ATP na koniec 5' cząsteczki sondy
lub
wbudowując w łańcuch sondy [γ 32P] - deoksyfosfonukleozydy w procesie „nick translation” (uzupełnienie przerw w dwuniciowej cząsteczce DNA, wywołanych uprzednio przez endonukleazę).
W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych struktur hybrydowych jest bezpośrednia autoradiografia.
Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórcze w znakowaniu sond molekularnych, polegające na dołączaniu biotyny lub digoksygeniny. Produkty hybrydyzacji wykrywa się wówczas w procesach dwustopniowych:
Etap I:
użycie streptawidyny wiążącej się wybiórczo z biotyną lub przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko biotynie czy digoksygeninie,
streptawidyna i przeciwciała sprzężone są z enzymami (peroksydaza chrzanowa lub fosfataza zasadowa).
Etap II:
w/w enzymy w obecności odpowiednich substratów powodują reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.
Hybrydyzacja Southern (ang. Southern blot hybridization)
hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego fragmentu DNA,
najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA - DNA,
Etapy :
1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.
2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.
3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ.
4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy.
5. Związanie DNA z filtrem: w temperaturze 80°C lub poprzez naświetlanie UV.
6. Hybrydyzacja z sondą.
7. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii i reakcji barwnych lub fluorescencji
Hybrydyzację z sondą dzielimy na trzy etapy:
Prehybrydyzacja:
eliminacja niespecyficznego tła poprzez moczenie filtru w roztworze, którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze,
w celu zminimalizowania tła dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe.
Właściwa hybrydyzacja:
wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi,
wysoka homologia: temperatura (65°C), mniejsze stężenie soli, dodatek formamidu,
częściowa homologia: temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli.
Płukanie filtru:
usunięcie niezhybrydyzowanej sondy - jest to warunek specyficznego obrazu hybrydyzacji.
Zastosowanie hybrydyzacja Southern umożliwia:
wykrycie rearanżacji genowych (np. delecje, insercje) większych niż 50 pz,
badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA - RFLP (restriction fragment length polymorphism).
Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może wystąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które powodują zanikanie bądź pojawianie się miejsc restrykcyjnych.
Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach dziedzicznych uwarunkowań chorób jak również w wykrywaniu mutacji somatycznych w badanych genach.
Hybrydyzacja Northern (ang. Northern blot hybridization)
Jest to metoda służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych genów(badanie ekspresji genów).
Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern:
rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach denaturujących,
przeniesienie RNA na odpowiednią membranę,
utrwalenie RNA na membranie,
hybrydyzacja RNA z sondą,
odpłukanie nadmiaru sondy i detekcja.
Sonda daje sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.
Hybrydyzacja DOT - BLOT
metoda półilościowa,
umożliwia jednoczesne wykrywanie i identyfikację wielu próbek na tym samym filtrze,
pozwala na bezpośrednie stosowanie komórek hodowanych in vitro lub bakterii w miejsce kwasów nukleinowych,
stosowana do wykrywania wirusów w diagnostyce chorób zakaźnych zwierząt chodowlanych.
DNA Fingerprinting (genetyczny odcisk palca)
Metoda oparta na hybrydyzacji Southerna.
Opracowana w 1984 roku przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa.
Polega na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów DNA.
Wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem repeats) - zmienna liczba tandemowych powtórzeń.
Występowanie w eukariotycznym DNA sekwencji powtórzonych, cechujących się dużą zmiennością, nadaje DNA poszczególnych osobników cechy indywidualne.
Metodyka:
trawienie wyizolowanego DNA odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych miejscach,
rozdzielenie i sortowanie poprzez rozdział elektroforeteczny pocięte fragmenty DNA,
przeniesienie rozdzielonych fragmentów DNA na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzacja z wyznakowanymi sondami,
detekcja.
W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznajacymi jednocześnie od kilkunastu do kilkudziesięciu loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. DNA fingerprint.
Zastosowanie:
badania medyczno - sądowe,
ustalanie ojcostwa.
PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction)
Należy do najczęściej stosowanych technik biologii molekularnej.
W znaczny sposób przyśpieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.
Umożliwia specyficzną amplifikacje in vitro wybranych odcinków DNA i RNA.
Charakteryzuje się wysoką czułością.
Rys historyczny
Izolacja polimerazy DNA z Thermus aquaticus (Chien 1974).
Wydłużanie starterów przy udziale fragmentu Klenowa polimerazy I z E.coli (Panet i Khorana 1974).
Cykliczne wydłużanie starterów (Saiki i wsp. 1985).
Zastosowanie termostabilnej polimerazy (Mullis i Faloona 1987, Saiki i wsp. 1998).
Klonowanie genu (Lawyer i wsp. 1989).
Rekordy
1. Długość fragmentu 6 kpz (obecnie 40 kpz fag lambda)
Ponce MR, Micol JL. PCR amplification of long fragments.
Nucleic Acids Res. 20, 623, 1992
2. Pojedynczy włos
Higuchi R., von Beroldingen C.H., Sensabauch S.A., Erlich H.A.
DNA typing from single cells. Nature 340, 35-42, 1988
3. Pojedyncza komórka
Li H., Gyllensten U.B., Cui X., Saiki R.K., Erlich H.A., Arnheim N.
Amplification and analysis of DNA sequences in single human
sperm and diploid cells. Nature 335, 414-417, 1988
4. Pojedynczy oocyt
Coutelle C., Williams C., Handyside A., Hardy K., Winston R.,
Williamson R. Genetic analysis of DNA from single human
oocytes: a model for preimplantation diagnosis of cystic fibrosis.
Br. Med.. J. 299, 22-24, 1989
Założenia reakcji
Technika enzymatycznej amplifikacji określonych sekwencji DNA.
Specyficzność reakcji zapewniają dwa startery komplementarne do sekwencji docelowej.
Czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów ponad 1 000 000 razy mimo obecności innych sekwencji.
Możliwość amplifikacji pojedynczych matryc.
Przebieg reakcji, cykle reakcji PCR:
Denaturacja wstępna - 92-95 ºC
Cykle (25-35): Denaturacja - 92-95 ºC, Wiązanie starterów - 40-62 ºC, Synteza - 68-72 ºC
Synteza końcowa - 68-72 ºC
Przechowywanie - 4 ºC
Skład mieszaniny reakcyjnej: Matryca DNA (RNA), Startery, dNTP, MgCl2, Polimeraza Taq, Bufor
Przebieg
denaturacja 94-95ºC - rozplecenie podwójnej nici DNA, czas ok. 30-60s
wiązanie starterów - przyłączanie (hybrydyzacja) starterów do matrycy ustalana doświadczalnie w zależności od składu nukleotydowego starterów czas ok. 30-60 s
synteza nici przez polimeryzację Taq 72ºC- na tym etapie zachodzi właściwa amplifikacja pożądanego fragmentu genu czas ok. 30-60s
reakcja PCR prowadzi do wzrostu ilości pożądanego fragmentu DNA
przerost ilości produktu wzrasta 2^n, gdzie n oznacza liczbę cykli, tak więc liczba matryc wzrasta wykładniczo np., po 30 cyklach liczba matryc wynosi 107 374 824 (2^30)
produkty jednego cyklu amplifikacji służą jako matryca dla następnego cyklu
produkt PCR jest dwuniciowym fragmentem DNA, którego końce określone SA przez sekwencję obu starterów
Analiza produktów PCR
1. Elektroforeza w żelach agarozowych: barwienie bromkiem etydyny, autoradiografia.
2. Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych: barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie, autoradiografia, fluorografia.
Zastosowanie PCR:
klonowanie (YAC, BAC, minigeny), hybrydyzacja (klony cDNA, produkty PCR), amplifikacja
analiza funkcji i ekspresji genów, diagnostyka prenatalna, wykrywanie GMO
mikrobiologiczne - wykrywanie bakterii, wirusów, pasożytów (np. wirus HIV, prądki gruźlicy)
onkologia - wykrywanie mutacji w onkogenach, genach supresorowych, monitorowanie przebiegu choroby, określenie predyspozycji do chorób nowotworowych
wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych
transplantologia - badania zmienności genów HLA decydujących o przyjęciu/odrzuceniu przeszczepu
medycyna sadowa - badania ojcostwa, kryminalistyka, identyfikacja osobnicza
RT-PCR PCR (ang. Reverse transcriptase PCR)
Matrycą wyjściową jest mRNA, które w procesie odwrotnej transkrypcji jest przepisywane na komplementarne DNA (ang. complementary DNA - cDNA). Następnie cDNA ulega amplifikacji, jak w zwykłym PCR.
Zastosowanie: Badanie ekspresji genów.
PCR multipleks
Metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów DNA, różniących się wielkością, co w praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie reakcyjnej kilku par starterów.
Zastosowanie: Jednoczesna amplifikacja kilku regionów jednego lub kilku genów. W jednej reakcji uzyskać można nawet 13 amplikonów.
PCR-RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism PCR)
Połączenie reakcji PCR z analizą restrykcyjną. Produkty amplifikacji poddaje się działaniu enzymu restrykcyjnego i porównuje wzór powstałych prążków.
Zastosowanie: Wykrywanie znanych mutacji/polimorfizmów. Analiza bezpośrednia - mutacje. Analiza pośrednia - polimorfizmy
Real-time PCR (PCR w czasie rzeczywistym)
Metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji w czasie rzeczywistym. Wraz z przybywaniem produktów PCR wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor. Odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze komputera.
Zastosowanie: Pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w materiałach klinicznych, u możliwia monitorowanie postępów leczenia (określenie wyjściowego poziomu wiremii lub bakteriemii jest wskazaniem koniecznym do rozpoczęcia właściwego leczenia).
Nested-PCR (PCR gniazdowy)
Stosowane są dwie pary starterów: zewnętrzna (komplementarna do końców poszukiwanej sekwencji) i wewnętrzna (przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do pierwszej pary starterów). Produkt powstały po amplifikacji z pierwszą parą starterów poddaje się kolejnej amplifikacji z druga parą. Zapewnia to większą specyficzność metody.
Zastosowanie: Szybka diagnostyka zakażeń wirusowych.
RAPD-PCR (ang. random amplified polymorphic DNA)
Wykorzystywana, gdy nieznane są sekwencje specyficzne. Stosuje się krótkie uniwersalne startery, którymi amplifikuje się zbiór produktów, a ich liczba i długość są zależne od sekwencji nukleotydowej matrycy oraz warunków reakcji.
Zastosowanie: Określenie zmienności genetycznej bez informacji o sekwencji analizowanego DNA
RACE-PCR (ang. rapid amplification of cDNA ends)
Technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości sekwencji gdy znany jest tylko fragment.
Zastosowanie: Klonowanie cDNA.
ASA-PCR(ang. allele specific amplification)
Technika umożliwiająca wykrywanie mutacji przy pomocy specyficznych oligonukleotydów. Oprócz starterów flankujących stosuje się starter w pełni komplementarny do allela z mutacją lub startery, z kórych jeden jest w pełni komplementarny do allela z mutacją a drugi do allela niezmutowanego. Startery są tak zlokalizowane, że w wyniku PCR powstają produkty różniące się długością w zależności od genotypu użytej próbki DNA.
Zastosowanie: Wykrywanie znanych mutacji.
Competitive-PCR (PCR konkurujący)
W mieszaninie reakcyjnej umieszcza się DNA badane oraz DNA kontrolne o znanym stężeniu. W wyniku konkurowania o reagenty ilość produktu DNA kontrolnego będzie odwrotnie proporcjonalna do ilości DNA badanego w probówce.
Zastosowanie: Ocena ilościowa produktu.
ĆW 2 MIKROMACIERZE DNA
Zastosowanie badań molekularnych:
wykrywanie mutacji związanych z chorobami
monitorowanie chorób o podłożu genetycznym
śledzenie sposobu dziedziczenia mutacji genetycznych w rodzinach oraz ustalenie nosicielstwa chorób genetycznych
określenie ekspresji genów
identyfikacja mutacji - określenie rodzaju mutacji
w kryminalistyce do identyfikacji osób, ustalenia spraw przestępstw w oparciu o badania sladów biologicznych
w dochodzeniu ojcostwa
Uzyskanie ostatecznych wyników diagnostycznych w badaniach molekularnych:
ocena polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych - RFLP
określenie długości badanego fragmentu DNA
określenie sekwencji badanego odcinka DNA
Metoda DNA microarray (mikromacierze DNA, mikrosiatki DNA, mikromoduły DNA, mikroprocesory DNA, chipy DNA)
Półilościowa metoda wykrywania
genów lub ich fragmentów
ekspresji genów
mutacji w genach
oraz porównania genów np. w celu badania ich ewolucji.
Przy użyciu zestawu kilkiset lub kilku tys. sond oligonukleotydowych, które umieszczone są w postaci plamek na jednaj płytce o wielkości mikroskopowego szkiełka nakrywkowego tworząc tzw. chipy genowe
DNA microarray - płytka szklana lub plastikowa z naniesionym w regularnych pozycjach mikroskopowej wielkości polami (ang. Spots) zawierającym fragmenty DNA różniące się od siebie sekwencją nukleotydów. Fragmenty te są sondami, które wykrywają poprzez hybrydyzację komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA. Bardzo czuła metoda i musi być zachowana czystość. W tej technice sond się nie znakuje np. materiał badany fluorochromami
Rodzaje macierzy:
ze względu na budowę sond
mikromacierze oligonukleotydowe - na płytce naniesione są krótkie na ogół 25-70 nukleotydowe sekwencje sond
mikromacierze cDNA - sondy znacznie dłuższe zazwyczaj odpowiadające pełnym sekwencjom mRNA, co w praktyce oznacza zazwyczaj kompletną sekwencję wariantu genu
ze względu na wykrywanie sekwencji
mikromacierze do badania ekspresji genów najczęściej stosowane -sondy w obrębie sekwencji mRNA
macierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów)
macierze pokrywające genom ( do badania ekspresji obszarów pozagenowych)
macierze do badania splicingu
mikromacierze do badania sekwencji genów
macierze SNP - odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA
Etapy metody:
1. Synteza jednoniciowych sond DNA w milionach kopii każda umieszczenie w postaci plamek na jednaj płytce i przymocowanie chemiczne lub elektryczne do podłoża. Wszystkie kopie unikalnej sondy zgromadzone są w jednaj plamce o powierzchni ok. 90x90μm. Plamki ułożone są w siatce , a ich pozycje odznaczone są w obu siach płytki
2. Przygotowanie badanego (jednoniciowego) DNA lub cDNA (przepisane z mRNA) wyizolowanego z komórki np. nowotworu
3. Wyznakowanie fluorochromem (np. Cy 3,Cy 5) badanego materiału
4. wprowadzenie badanego materiału do plamek z poszczególnymi sondami. DNA lub cDNA jest wiązany do sond na zasadzie komplementarności zasad (hybrydyzacja)
5. Niezwiązany lub słabo związany DNA lub cDNA jest usuwany na etapie odpłukiwania.
Detekcja
DNA lub cDNA wcześniej wyznakowany fluorochromem w celu umożliwienia wizualizacji hybrydów
plamki z hybrydami oświetlane światłem laserowym (…)
obraz sczytuje ilościowo (za pomocą lasera lub mikroskopu)
intensywność sygnału dla poszczególnych sond jest proporcjonalna do ilości kw. nukleinowego o danej sekwencji w próbce oraz siły wiazania
Analiza
dane z mikromacierzy trzeba poddać wstępnej obróbce
analiza zeskanowanego obrazu - obliczenia intensywności sygnału dla każdej sondy
odjęcie sygnału sondy
normalizacja danych - modyfikowanie wartości ekspresji w celu dostosowania do całości eksperymentu lub do zamierzonego rozkładu, niezbędna dla porównywania intensywności między macierzami
sumaryzacja danych - podsumowanie wartości dla grup sond.
Może być wykonywane dla każdej grupy sond osobno lub za pomocą globalnego modelu dla całego doświadczenia.
Umożliwia
udoskonalenie i ułatwienie diagnostyki chorób o podłożu genetycznym oraz prognozowanie ich przebiegu
zindywidualizowanie toku leczenia poszczególnych pacjentów w zależności od ich swoistej postaci choroby
Obawy Genechip
drobny ślad biologiczny (kropla krwi, włos) ->brama do wiedzy o całym genomie
automatyzm i szybkość badania
potencjalne sytuacje: zatrudnienie elita genetyczna, ubezpieczenie dyskryminacja, wybór partnera życiowego eugenika, wybór embrionu eugenika
ĆW. 3 BADANIA CYTOGENETYCZNE
Cytogenetyka kliniczna - dział genetyki zajmujący się badaniami chromosomów w komórkach organizmu ludzkiego, ich abberacji oraz związku nieprawidłowości z obrazem klinicznym.
Badania cytogenetyczne - genetyka komórki jądrzastej; bada się chromosomy w metafazie, oznaczenie kariotypu, liczby i struktury chromosomów
Metody badań cytogenetycznych:
klasyczne badania cytogenetyczne - polega na ocenie liczby i morfologii chromosomów uzyskanych z jądek komórek poddawanych hodowli komórkowej
cytogenetyka molekularna:
FISH - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ pozwala na badanie jądek komórkowych w stadium metafazy jak i interfazy przy wykorzystaniu odpowiedniej sondy molekularnej
CGH - porównywawcza hybrydyzacja genowa to modyfikacja metody FISH. Wykrywa obecność dodatkowego lub brak materiału genetycznego
Kariotyp konstytucyjny - ten, z którym się rodzimy; z krwi, płynu owodniowego
Kariotyp nabyty - powstał w wyniku choroby(np. nowotwory); nie dziedziczy się
Wskazania do badań cytogenetycznych:
Badania postnatalne: wystąpienie zespołu wad rozwojowych i lub cech dysmorficznych, podejrzenie zespołu genetycznego np. zespołu Downa, opóźnienie rozwoju psychoruchowego i lub umysłowego, brak cech dojrzewania płciowego lub cechy przedwczesnego dojrzewania płciowego,kliniczne zaburzenia wzrostu, pierwotny lub wtórny brak miesiączki o nieustalonej etiologii, choroba recesywna związana z chromosomem X u dziewczynki lub kobiety, więcej niż dwa poronienia samoistne, wykrycie abberacji chromosowej w badaniu prenatalnym płodu pacjentki, niepłodnośc nieznanego pochodzenia, przed zabiegiem in vitro, występowanie znanej abberacji strukturalnej w rodzinie
Badanie prenatalne - wiek matki powyżej 35rż, urodzenie dziecka z abberacją chromosomalną, urodzenie żywe lub martwe dziecko z wadami wrodzonymi, wystąpienie abberacji u jednego z partenrów, pokrewieństwo rodziców, nieprawidłowości w przesiewowym badaniu USG i lub testów biochemicznych w surowicy krwi matki
Materiał do analizy cytogenetycznej:
krew obwodowa - limf T, badania postnatalne
fibroblasy - gdy wynik kariotypu konstytucyjnego krwi obwodowej nie odpowiada fenotypowi pacjenta
komórki kosmówki - droga aspiracji przez powłoki brzuszne, między 8 a 11 tyg; materiał trzeba oczyścić z tkanki matczynej
amniocyty - komórki płodu pochodzące z owodni - skóra, ukł pokarmowy, moczowy; badania prenatalne (amnipunkcja wczesna: 11-14 tyg, późna: 15-17 tyg)
szpik kostny (białaczki) - kariotyp nabyty
komórki guzów litych: płyny wysiękowe, biopsja guza. Należy mechaniczne rozdrobnić tkanki, wrzucić do naczynia hodowlanego, dodać kolagenozę. Powstaje pierwotna zawiesina komórkowa przeznaczona do hodowli
krew pępowinowa
Etapy hodowli w badaniu cytogenetycznym:
pobranie:
jałowe pobranie krwi na heparynę o temp 37 st.C lub 4 st.C
ok. 5 ml (krew), 2-4 ml (szpik)
zakładanie hodowli komórkowej (w 2 sterylnych flakonach)
4 ml pożywki RPMI z 1 ml płodowej surowicy cielęcej lub surowicy AB
mitogen np. LF-7 (mukoproteina z wyciągu z fasoli), PHA - fitohemaglutynina (0,2 ml)
antybiotyk
krew
mitogen dodajemy w zależności od rodzaju białaczki. Warunki hodowli: 37 st.C, 5% CO2, 24 - 72 h, wilgotność. Na 1,15 h przed zakończeniem hodowli dodajemy kolcemid, aby zahamować powstawanie wrzeciona kariokinetycznego.
zahamowanie hodowli i opracowanie:
odwirowanie 1500 obr/min przez 10 min
supernatant odlewamy, ważny jest osad; komórki muszą pęknąć
szok hipotoniczny (0,075 M KCl, 37 st.C): 40 min - szpik kostny, 30 min - krew
odwirowanie 1500 obr/min przez 10 min
3x utrwalanie w mieszaninie metanol : lodowaty kwas octowy w stosunku 3 : 1 (4 st.C, I utrwalacz - 30 min, II i III - 15 min)
materiał taki kładziemy na szkiełko i szukamy metafaz. Ważne, aby uzyskać chromosomy o dużej rozdzielczości prążkowej (400, 550 lub 1250).
Metody otrzymywania chromosomów większej rozdzielczości w stadium profazy i prometafazy:
naturalna - wyszukiwanie metafaz profazalnych i prometafazalnych
zapobieganie spiralizacji przez dodanie substancji interkalujących (bromek etydyny, aktynomycyna D), które hamują kondensację.
zablokowanie cyklu komórkowego przejściu G1-S - najczęściej stosowany metotreksat; synchronizacja hodowli za pomocą ametopteryny lub tymidyny w celu zwiększenia w hodowli liczby komórek w stadium profazy i wczesnej metafazy.
Techniki prążkowe - umożliwiają precyzyjną identyfikację każdego chromosomu, identyfikację brakującego lub dodatkowego materiału chromosomowego(o wielkości co najmniej 4Mb), wybarwienie konkretnych fragmentów:
GTG (prążki G, trypsyna, Giemsa) - najczęściej stos. do oceny kariotypu ,tą metodą uzyskuje się 300-400 prążków ciemnych i jasnych charakterystyczne dla każdej pary chrom. Prążki ciemne zawierają skondensowaną chromatynę = heterochromatynę (dostęp trypsyny do niej jest utrudniony), bogatą w pary zasad A-T, zawierającą stos. mało aktywnych genów. Jest to obszar wolnoreplikujący (replikuje się późno w fazie S) Prążki jasne zawierają euchromatynę, 80% aktywnych genów, dużo par C-G, obszary te replikują się wcześnie. Aby widoczne były mutacje musi być min. 400 prążków na kariotyp. W profazie i prometafazie rozdzielczość jest max.(występuje Ok. 500-850 prążków na kariotyp-możliwe jest stwierdzenie mikromutacji).
GTW (pr.G, trypsyna, b.Wrighta)
CBG (prążki C, Ba(OH)2, Giemsa) - Ba(OH)2 wiąże się z heterochromatyną konstytucyjną (występuje ona w centromerach wszystkich chromosomów, w okolicach satelitarnych chromosomów akrocentrycznych-13,14,15,21,22, na końcu ramienia długiego chromosomu Y); dotyczy chromosómów 1,9,16
QFQ (pr.Q, fluorochrom, quinakryna) - wybarwiają się okolica centromeru chromosomu 3, okolica centromeru i regionu satelitarnego chromosomów akrocentrycznych 13, 14, 15, 21, 22 oraz odcinki dystalnej ramion długich chromosomu Y
RHG (pr.R, hydroliza na ciepło, Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG, metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.
AgNOR - organizatory jąderkowe traktowane azotanem srebra; stosowane przy białaczkach, bo występuje duża proliferacja i duże organizatory jąderkowe. Identyfikowane w chromosomach akrocentrycznych13-15, 21-22 oraz ich wariantów akrocentycznych
Rozdzielczość prążków - im wyższa tym większa liczba prążków, która daje możliwość zidentyfikowania większej ilości abberacji. Standardowo 400-550 prążków na haploidalny zestaw chromosomów (identyfikacja abberacji liczbowych). Minimum 550 (aberacje strukturalne). 850 lub > (mikrodelecje związane z zespołami wad)
Kariogram - zestaw poukładanych parami chromosomów
Klasyfikacja chromosomów:
A - 1, 2, 3 - duże metacentryczne
B - 4, 5 - duże submetacentryczne
C - 6 - 12, X - średnie submetacentryczne
D - 13 - 15 - duże akrocentryczne
E - 16 - 18 - małe submetacentryczne
F - 19 - 20 - najmniejsze submetacentryczne
G - 21 - 22, Y - małe akrocentryczne
Chromosom Y- heterochromatyna w długich ramionach
ĆW. 4 ABERRACJE CHROMOSOMOWE
Aberracje - zaburzenia w liczbie lub strukturze chromosomów; mutacje materiału genetycznego widoczne pod mikroskopem świetlnym (najmniejszy widoczny dodatek lub delecja wynosi ok. 0,13%, czyli 4 mln pz), do aberracji może dochodzić spontanicznie lub pod wpływem działania czynników mutagennych takich jak :promieniowanie UV, jonizacja, wysoka temperatura i inne.
liczbowe (nieprawidłowa liczba chromosomów)
aneuploidia - 2n - 1, 2n +1 (złe rozchodzenie się chromosomów = nondysjunkcja)
poliploidie - 3n, 4n; powstają: z zapłodnienia komórki jajowej przez 2 lub więcej plemników, zaburzenia podziału zygoty, zaburzenia podziału dojrzałego jaja lub plemnika i powstanie gamety diploidalnej;
strukturalne (komórki somatyczne zawierają jeden lub więcej chromosomów nieprawidłowych; mogą dotyczyć autosomów lub chromosomów płci):
zrównoważone - nie ma zmiany w ilości materiału genetycznego, np. translokacja wzajemna, inwersja; skutki nie zawsze są widoczne: zmiana ramki odczytu; są przyczyną powstawania w mejozie gamet z nieprawidłowym zestawem chromosomów. Może być przekazana na następne pokolenie jako zrównoważona lub niezrównoważona
niezrównoważone - zwiększenie materiału, np. duplikacja, addycja lub ubytek - delecje; skutki fenotypowe są widoczne
Aberracje strukturalne
a) Translokacje - przemieszczenie materiału pomiędzy chromosomami:
wzajemne - wymiana materiału między 2 chromosomami np. t(8;22)(q34;q11); powstaje w wyniku złamań chromosomów niehomologicznych lub przez przypadkową rekombinacje między chromosomami podczas mejozy
robertsonowskie = fuzje centryczne; dotyczy chromosomów akrocentrycznych grupy D i G, w których złamanie następuje w centromerze lub blisko niego; powstaje chromosom z 2 centromerami; krótkie ramiona zawierające nieczynną genetycznie heterochromatynę są eliminowane
insercje - jeden chromosom ma 2 pęknięcia, a drugi jedno, np. ins(6;18)(q21-22;q221)
b) Inwersje - chromosom pęka w dwóch miejscach i dochodzi do odwrócenia materiału genetycznego 180 st
paracentryczne - złamanie w obrębie jednego ramienia np. inv(6)(q25;q31)
pericentryczne - złamanie w obrębie dwóch ramion łącznie centromerem np. inv(6)(p22;q31)
Duplikacje - podwojenie fragmentu chromosomu np. dup(6p)
Chromosom kolisty - powstaje przez delecję części terminalnej ramiona krótkiego bądź długiego „lepkie” końce, które łączą się; układa prążków jest zachowany; są one niestabilne i w czasie podziału powstaje chromosom dicentryczny
Izochromosom - powstaje w wyniku poprzecznego podziału centromeru; duplikacja jednego ramienia i delecja drugiego; skutki fenotypowe: najczęściej ilościowe zmiany letalne np. i(X)(p10) oraz i(X)(q10)
Chromosomy markerowe - pochodzenie i mechanizm powstawania jest nieznany. Najczęściej jest to chromosom akrocentryczne lub metacentryczne.
Addycja - dodatkowy materiał chromosomowy nieznanego pochodzenia np. add(19)(p13)
Chromosom pochodny - znane są okolice i centromer danego chromosomu der(6)t(6;18)
c) Delecje - utrata fragmentu chromosomu
terminalna - złamanie w części dystalnej chromosomu np. del(6)(q34)
interstycjalna - podwójne złamanie np. del(6)(q25;q34)
chromosom pierścieniowy - 2 delecje terminalne -> powstają lepkie końce, które łączą się
mikrodelecje - utrata fragmentu, którego wielkość zbliżona jest do granicy rozdzielczości mikroskopii świetlnej. Można je wykryć za pomocą specjalnych technik biologii molekularnej.
Jeżeli aberracja chromosomowa obecna jest we wszystkich komórkach somatycznych, mówimy wówczas o homogenności.
Mogą jednak istnieć różne linie komórkowe - z aberracja i bez, nazywamy to mozaikowością.
Może mieć również miejsce mozaikowatość gonadalna komórki somatyczne i gonady mają różny kariotyp
ĆW. 5 FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITHU (FISH)
FISH łączy w sobie elementy cytogenetyki klasycznej i metod molekularnych.
Zasada metody: hybrydyzacja polega na tworzeniu dwuniciowych kompleksów między sondą molekularną a badanym jednoniciowym fragmentem DNA lub RNA (zgodnie z zasadą komplementarności).
Fragment DNA znakowany i doprowadzany do formy 1- niciowej przez ogrzanie i gwałtowne ochłodzenie → nakładany na wysuszone powietrzem, zdenaturowane preparaty chromosomów → przyłączona do odpowiadających jej w chromosomie sekwencji sonda molekularna widoczna w mikroskopie.
Metoda mapowania sklonowanych sekwencji DNA stos. standartowo, wynik 1-2 dni!
Znakowanie nie izotopowe oparte na wbudowywaniu biotyny do sondy DNA. Miejsce hybrydyzacji wykrywane przy użyciu antybiotyny (streptawidyny) sprzężonej z barwnikiem fluorescencyjnym. Kompleks analizowany w mikroskopie fluorescencyjnym zhybrydyzowane sekwencje musza być odlegle od siebie o min. 1 Mb.(chromosomy metafazowe) większa rozdzielczość metody przy użyciu mniej skondensowanych chromosomów w jądrach interfazowych (tu możliwe rozróżnienie sygnałów odległych o 50-100 kb), jeszcze większa rozdzielczość w met. gdzie włókna chromatynowe uwalniane są ze szkieletu białkowego (fiberFISH) tu możliwe rozróżnienie sekwencji odległych o mniej niż 10 kb.
Sonda molekularna - fragment DNA, którego sekwencja nukleotydów jest specyficzna względem badanego regionu. Sondą może być:
syntetyczny lub naturalny gen lub jego fragment
syntetyczny oligonukleotyd
cDNA
fragment chromosomu
fragment genomowego DNA
Metody otrzymywania sond:
klonowanie odpowiedniego fragmentu DNA
synteza chemiczna (20 - 50 pz)
sondy złożone otrzymuje się przez klonowanie całego chromosomu, cięcie go enzymami restrykcyjnymi, elektroforeza, denaturacja
Fluorochrom - rodamina barwnik czerwony, FITC zielony, czerwień Texasu czerwony, DAPi niebieski
FISH - interfazalny i metafazalny
materiał po hodowli, rozmaz krwi lub szpik kostny, musi być utwardzony
szkiełko odtłuszczone
chromosomy nie mogą być w cytoplazmie, utrudniona jest penetracja sondy
materiał nie może być zbyt gęsto i zbyt rzadko naniesiony na szkiełko
Etapy hybrydyzacji: 1.Sporządzanie i wyznakowanie sondy; 2. Przygotowanie preparatu; 3. Denaturacja sondy i preparatu; 4. Hybrydyzacja
Etapy: materiał na szkiełko, dehydratacja szkiełka (alkohol), nałożenie sondy, zaklejenie szkiełka klejem, denaturacja materiału i sondy, hybrydyzacja w 37st, 12h w ciemności, odpłukiwanie, nałożenie PAPi, detekcja sondy, analiza (mikroskop fluorescencyjny, źródło promieniowania- lampa rtęciowa, zestaw filtrów, aparat cyfrowy lub system komputerowy)
Rodzaje sond:
specyficzne (unikatowe) dla danej sekwencji DNA
do identyfikacji mikrodelecji, geny fuzyjne, submikroskopowe aberracje, w czasie metafazy i oraz jądra interfazowe, fuzje genowe - analizuje się przy białaczkach - 95% pacjentów z CML ma t(9;22)(q34;q11) z fuzją genową BCR/ABL1 (tzw. PH) i ABL1/BCR (9q+), identyfikacja pewnych genów istotnych w rozwoju nowotworów
mikrodelecje zespoły: Williamsa 7q11.23, DiGoerga 22q11.2, Millera Diekera 17p13.3, Cri Du chat sp15, Retinoblastoma 13q14, Pradego-Willera/ Angelmana 15q12
komplementarne do sekwencji powtórzonych
w czasie metafazy oraz jądra interfazowe, centromerowe- α satelitarne DNA komplementarne do tandemowych powtórzeń (171 pz) , telomerowe- komplementarne do telomerów składających się z krótkich sekwencji powtarzalnych, komplementarne do heterochromosomów konstytutywnych, wykorzystuje się je przy przeszczepach, w celu sprawdzenia jak się przyjęły, gdy dawca i biorca różnili się płcią = chimeryzm przeszczepowy)
złożone (malujące) dla całego chromosomu lub ramienia
w czasie mateafazy, chromosomy markerowe, dodatkowy materiał chromosomowy, złożone lub ukryte translokacje, aneuploidie, zaburzenia ilości chromosomów płci, zastosowanie do translokacji wzajemnych, translokacji złożonych - 3 lub więcej chr, M FISH = Mulitcolor FISH (różne kolory dla każdej pary)
Zastosowanie sond i FISH'a:
wykrywanie addycji chromosomowych nieznanego pochodzenia
identyfikacja chromosomów markerowych
wyjaśnienie charakteru translokacji złożonych
wykrycie mikrodelecji
wyjaśnienie złożonych aberracji struktury
identyfikacja aberracji liczbowych
badanie struktury i organizacji chromosomów (mapowanie i ekspresja genów)
ĆW. 6 CHOROBY MONOGENOWE
Cele analizy genetycznych uwarunkowań dobrostanu:
ocena ryzyka wystąpienia u płodu chorób uwarunkowanych genetycznie, wad rozwojowych
wyodrębnienie ciąż wysokiego ryzyka i rozpoznanie patologii genetycznych; współudział w kształtowaniu dalszych decyzji diagnostycznych i leczniczych
określenie ryzyka genetycznego dla następnej ciąży
Ryzyko genetyczne:
jest oceniane jako prawdopodobieństwo wystąpienia zdefiniowanego zaburzenia
powinno być ocenione ilościowo
dotyczy zawsze określonej pary
małe < 5 % - teoretyczne wyliczone z praw Mendla dla chorób jednogenowych, rodzinnych abberacji strukturalnych chromosomów
średnie 5 - 10 % - zmodyfikowane jak wyżej z uwzględnieniem dodatkowych poprawek
duże > 10% - empiryczne z obserwacji populacyjnych dla chorów wielogenowych, abberacji liczbowych chromosomów, zespołów wad
teoretyczne:
wyliczone z praw Mendla dla chorób jednogenowych
rodzinnych aberracji strukturalnych chromosomów
zmodyfikowane: jw. z uwzględnieniem
dodatkowych poprawek
empiryczne:
z obserwacji populacyjnych, dla chorób wielogenowych, aberracji liczbowych chromosomów, zespołów wad
Techniki diagnostyki genetycznej:
analiza rodowodowo - kliniczna: dane o zachorowaniach, utratach ciąż, niepłodności w zakresie wszystkich krewnych I°, wsparte dokumentacją lekarską, fotograficzną itp. Weryfikacja charakteru dziedziczenia; niekiedy może być nietypowy w określonej rodzinie. Taki sam fenotyp może wynikać z różnych uwarunkowań. Zapis symboliczny umożliwia lepszą orientację w uwarunkowaniach.
analiza fenotypu
analizy laboratoryjne
diagnostyka cytogenetyczna
diagnostyka molekularna DNA i RNA
diagnostyka biochemiczna
Dziedziczenia autosomalne dominujące i recesywne
wg Mc Kusicka z roku 2000 - 11 000 chorób monogenowych, obecnie około 16 000
10671 cechy zlokalizowane na autosomach
624 na chromosomie X
cechy monogenowe - cechy mendlowskie: zasady segregacji, zasady niezależnego doboru
Prawa Mendla:
zasada segregacji: organizmy rozmnażające się w sposób płciowy posiadają geny, które występują parami, ale tylko jeden gen danej pary jest przekazywany potomstwu.
zasada niezależnego doboru: geny zlokalizowane w różnych loci są przekazywane kolejnym pokoleniom niezależnie.
Prawdopodobieństwo genetyczne - jest to procentowa możliwość wystąpienia danego wyniku w serii zdarzeń
Genotyp - genetyczna budowa jednostki w badanym locus.
Fenotyp - rzeczywisty obraz fizyczny lub kliniczny danej jednostki. Jest wynikiem współdziałania pomiędzy genotypem i czynnikami środowiskowymi.
Rodowód - określa związki pomiędzy członkami rodzin i pokazuje, którzy z nich są dotknięci chorobą genetyczną, a którzy nie.
Dziedziczenie autosomalne dominujące:
1/200 osób
chory rodzic może przekazać swoim dzieciom gen „zdrowy” lub „chory”
prawdopodobieństwo - 1/2
osobnicy obu płci wykazują cechę chorobową w równych proporcjach
dana cecha pojawia się w każdym pokoleniu (pionowy schemat przekazywania choroby)
chora heterozygota przekazuje cechę połowie swoich dzieci
choroby jednogenowe AD - penetracja genu
manifestuje się „w pionie” niezależnie od płci, niekiedy częste mutacje de novo ( wtedy izolowana, ryzyko rośnie z wiekiem ojca), ale zwykle wywiad dodatni ryzyko rzeczywiste zwykle mniejsze od teoretycznego ze względu na niższą penetrację i ekspresję mutacji
ekspresja zależna od genów modyfikujących i środowiska, penetracja od charakterystyki mutacji
niekiedy homozygoty nie przeżywają do terminu porodu
zróżnicowany obraz choroby
wpływ na ekspresje genu ma środowisko
zjawisko „luki genetycznej” osoba bez objawów jest nosicielem
przykłady chorób AD: defekty białek strukturalnych, Predyspozycje do nowotworów, Fakomatozy, Pląsawica Huntingtona, PKD, Otoskleroza
Dziedziczenie autosomalne recesywne:
rodzice osób chorych na choroby recesywne to heterozygotyczni nosiciele
1/4 potomstwa będzie zdrowymi homozygotami, 1/2 fenotypowo zdrowymi heterozygotami, 1/4 homozygotami, u których wystąpi choroba
choroby występują u jednego lub kilku członków rodzeństwa, ale nie we wcześniejszych pokoleniach
mężczyźni i kobiety chorują w równych proporcjach
średnio 1/4 potomstwa dwóch heterozygotycznych nosicieli będzie dotknięta chorobą
najczęściej choroba ujawnia się w związkach pokrewieństwa (większe prawdopodobieństwo posiadania wspólnych genów)
choroby jednogenowe AR - penetracja genu:
choroba manifestuje się „w poziomie”,
wywiad rodzinny często ujemny
występuje równie często u obu płci, częstsze w małżeństwach krewniaczych ryzyko zmodyfikowane zwykle równe teoretycznemu często możliwa identyfikacja nosicieli
przykłady chorób AR: mukowiscydoza, Bloki metaboliczne, Retinitis, Defekty reparacji DNA, SLO, Immunodeficyty i in.
Choroby sprzężone z chromosomem X:
manifestują się w pionie współwystępując zazwyczaj z płcią
mogą być dziedziczone recesywnie lub dominująco
recesywny mogą manifestować się u kobiet (homozygota, delecje X),
u kobiet obligatoryjne nosicielstwo, mozaikowość somatyczna
dominujące manifestują się u kobiet i mężczyzn, męskie hemizygoty i żeńskie homozygoty niekiedy nie dożywają do terminu porodu
przykłady: hemofile A i B, DMD/BMD, AIS, FRA-X, nsXMR, SMA, Retinitis, Alport S., OFDS, Incontinentia pignenti, Krzywica oporna na vit D
Nietypowe choroby jednogenowe:
choroby sprzężone z chromosomem Y: tylko w linii męskiej, defekty spermatogenezy
mutacje genomu mitochondrialnego: dziedziczenie matczyne
mutacje dynamiczne: antycypacja, w dziedziczeniu dominuje zwielokrotnienie 3 nukleotydów, objawy po przekroczeniu krytycznej ilości powtórzeń, w każdym kolejnym pokoleniu ujawnia się szybciej i jej przebieg jest cięższy np. Pląsawica Huntingtona, zespół łamliwego chromosomu X
ĆW. 7 DZIEDZICZENIE WIELOGENOWE, WIELOCZYNNIKOWE
Dziedziczenie wielogenowe - odnosi się do tych procesów, w których choroba lub wada jest rezultatem sumującego się efektu działania jednego lub wielu genów i czynników środowiskowych. Zalicza się do dziedziczenia małego (do 5%)
Kryteria dziedziczenia wieloczynnikowego:
istnieje podobna wielkość ryzyka powtórnego wystąpienia choroby (zwykle 2-10%) u krewnych I stopnia
I dziecko z rozszczepem podniebienia - ryzyko powtórzenia dla kolejnego dziecka 4%
Rozszczep podniebienia u jednego z rodziców - ryzyko dla dziecka 4%
niektóre choroby wykazują szczególną zależność od płci
Wrodzone zwężenie odźwiernika - częściej u chłopców
Wrodzone zwichnięcie stawów biodrowych - częściej u dziewczynek
Ryzyko powtórzenia się choroby w rodzinie spada gwałtownie w miare oddalania się pokrewieństwa względem osoby chorej
Ryzyko powtórzenia się rozszczepu wargi dla kuzynostwa - 0,5%
ryzyko wystąpienia wady u dziecka urodzonego z kolejnej ciąży zależy od tego, czy wada wystąpiła u dzieci z ciąż poprzednich
Ryzyko ponownego urodzenia dziecka z rozszczepem wargi i podniebienia wynosi 4%, jeśli rodzice już mają dziecko z ta wadą
9% - po urodzeniu dwojga dzieci z tą wadą
ryzyko wystąpienia wady u kolejnego potomstwa zależy od ciężkości wady
Gdy dziecko ma wrodzony brak unerwienia błony śluzowej długiego odcinka jelita grubego, istnieje większe ryzyko, że wada ta wystąpi u kolejnego rodzeństwa, niż wtedy, gdy wada dotyczy niewielkiego odcinka jelita
dziedziczenie wieloczynnikowe jest rozpoznawane po wykluczeniu innych typów dziedziczenia
Czynniki teratogenne:
endogenne - produkowane w toku procesów metabolicznych np. wolne rodniki tlenowe, tlenki azotu
egzogenne - biologiczne (wirusy), chemiczne (benzen) i fizyczne (promieniowanie jonizujące)
Czynniki mutagenne indukują zmiany w genomie, które można obserwować na wszystkich poziomach jego organizacji: chromosomów, genów i nukleotydów. Teoretyczna częstość samoistnych mutacji wynosi dla jednej generacji komórek ok. 10-7 mutacji na gen. Istnieją mutageny, które zwiększają częstość mutacji ponad 1000 krotnie.
Większość uszkodzeń DNA zostaje usunięta za pomocą systemów reperacyjnych komórek. Jeśli uszkodzenia DNA nie zostaną usunięte, zmiana genetyczna może zostać utrwalona w postaci mutacji.
Konsekwencje biologicznych mutacji dotyczą pojedynczej komórki lub całego organizmu.
Komórki z uszkodzonym DNA mogą wejść w cykl podziałowy, co prowadzi do powstania linii komórek zawierających mutację.
Mutacje może spowodować zanik cyklu komórkowego, „kom drzemiąca” która ponownie może wejść do cyklu po zadziałaniu promotorów np. pobudzających proliferację komórek
Zmiana informacji może doprowadzić do zaburzenia podstawowych funkcji życiowych komórki, tak że będzie przyczyną jej śmierci.
W odniesieni do całego organizmu biologiczne działanie czynników mutagennych może wyrażać się:
mutageneza- mutacja komórek rozrodczych
kancerogeneza- transformacje nowotworowe, somatyczne
teratogeneza- indukcja wad wrodzonych, uszkodzenie zarodka
Skutki biologiczne zależą od typu komórek, które zostały uszkodzone (komórki płciowe lub somatyczne):
uszkodzenie komórek płciowych:
obniżenie płodności lub mutacje będą zawierały wszystkie komórki płodu (jeżeli komórka z mutacją weźmie udział w procesie zapłodnienia)
poronienia
urodzenie dziecka z abberacjami chromosomowymi zespołem uwarunkowanym mutacją pojedynczego genu lub z chorobą nowotworową
uszkodzenie somatyczne:
zmiana będzie się powtarzała jedynie w linii komórek wywodzących się z nieprawidłowej komórki
okres prenatalny: przed organogenezą (pierwsze 2 tygodnie), w trakcie organogenezy (pierwsze 2 miesiące) i po organogenezie (teratogeneza)
okres postnatalny (wpływ rakotwórczy): indukcja transformacji nowotworowej
Mutacja komórek somatycznych - etapy karcenogenezy:
indukcja (pierwsza zmiana zwykle genetyczna, zapoczątkowująca proces transformacji)
promocja (etap proliferacji pierwotnie uszkodzonej komórki)
progresja (nabycie przez linie komórek cech nowotworu złośliwego)
Proces transformacji nowotworowej wynika z kumulacji zmian:
genetycznych np. mutacje punktowe, delecje, amplifikacje, mutacje liczby i struktury chromosomów w trzech grupach genów: protoonkogenów, genów supresorowych i mutatorowych
epigenetycznych np. regulacja ekspresji genów kontrolujących cykl komórkowy, różnicowanie komórek i ich adhezyjność
Zależność między wzrostem narażenia a ryzykiem indukcji procesów nowotworowych jest: BEZPROGOWA i LINOWA.Wzrost narażenia nie jest równe ciężkości przebiegu. Ryzyko transformacji nowotworowej występuje przy każdym narażeniu na działanie czynników teratogennych. Efekt teratogenny jest skutkiem zaburzeń dotyczących wielu komórek, wynikających z uszkodzenia DNA lub innych molekół.
Teratogen - każdy czynnik uszkadzający materiał genetyczny, lub mechanizmy powiązane z replikacją, transkrypcją i translacją w wyniku czego zachodzi do zaburzenia funkcji i podziałów komórki. Zaburzenia w trakcie życia płodowego powodują zaburzenia procesów tworzenia się i rozwoju narządów płodu.
Efekt teratogenny to skutek uszkodzenia wielu kom w wyniku czego następuja:
zmiany ekspresji genów
zaburzenia apoptozy
zaburzenia migracji
zaburzenia poliferacji
zaburzenia syntezy i funkcji białek
zaburzenia produkcji energii
Wady wrodzone indukowane działaniem czynników teratogennych mogą być zmianami:
anatomicznymi (dysplazje, malformacje, deformacje, dystrupcje)
funkcjonalnymi (ślepota, głuchota, upośledzenie rozwoju umysłowego)
Talidomid - powodował fokomelia (brak rozwoju kończyn górnych i lub dolnych), blokuje IGF-1 i FGF-2, które są odpowiedzialne za regulacje transkrypcji, podjednostki av i β3 integryn stymulujących angiogeneze w kończynach. Sekwencje promotorowe genów IGF-1 i FGF-1 oraz av i β3 nie posiadają sekwencji TATA, ale sekwencje powtarzalne GG.
Kwas retinoidowy - reguluje rozwój szkieletu poprzez: jądrowe receptory hormonów RARs oraz RXRs, zaburzenia w syntezie RARs zaburzają proces tworzenia chrząstek, co w konsekwencji powoduje zaburzenie różnicowania się chondroblastów.
Nikotyna - powoduje wzrost ekspresji genu c-fos, który indukuje apoptozę w prawidłowych komórkach, prowadzi to do zaburzenia procesów różnicowania komórek neuronalnych.
Teratogeny swoiste: toksoplazma, różyczka, ospa wietrzna, alkohol etylowy, talidomid
Efekt teratogenny dawki - zależy od dawki progowej, nie ma dawki bezpiecznej, po przekroczeniu jej następuje wzrost wystąpienia i ciężkości uszkodzeń płodu
Genopatie - czynniki mutagenne działające na komórki rozrodcze przed zapłodnieniem prowadzące do mutacji
Blastopatie - uszkodzenie zapłodnionej komórki jajowej do 14 dnia po zapłodnieniu, zasada „wszystko albo nic”
Embriopatie - wada w okresie 14-60 dzień po zapłodnieniu
Fetopatie - wady indukowane działaniem czynników po 60 dniu od zapłodnienia (śmierć, zaburzenie funkcjonowania, upośledzenie wzrostu, dysfunkcja OUN)
Efekt teratogenny: poronienie, opóźniony rozwój płodu, przedwczesne porody, wzrost śmiertelności noworodków
Etiologia wad wrodzonych:
>50% przypadków - etiologia nieznana
10% to abberacje chromosomalne
10% to znane czynniki mutagenne
20% to mutacje pojedynczego genu
Indywidualne zróżnicowanie wrażliwości/podatność na działanie teratogenów zalezy od getoypu matki i od genotypu dziecka
Podatność zależy od: transportu łożyskowego, absorbcji i dystrybucji, metaboliźmie teratogenów chemicznych, sprawności mechanizmów naprawy DNA
Wady budowy ciała:
malformacje - wady rozwojowe narządu lub części ciała powstające w wyniku zaburzenia ich rozwoju w pierwszym trymestrze ciąży, co prowadzi do niepewnej lub nieprawidłowej morfogenezy. Są to zmiany wywołane przez pierwotne zaburzenie rozwoju w okresie zarodkowym, charakteryzują się trwałymi wadami budowy, im później powstaje defekt, tym prostsza jest malformacja, mogą być wywoływane przez 3 typy zaburzeń morfogenezy (niecałkowita (najczęściej), nadmierna, ektopiczna), malformacje (ograniczone, zespół malformacyjny ze zmianami w wielu układach)
deformacje - nieprawidłowości budowy, kształtu lub ułożenia jakiejś części ciała spowodowanych jej uciskiem wewnątrz macicy. Wady powstające zwykle w III trymestrze ciąży pod wpływem czynników mechanicznych
przyczyny: wady rozwojowe macicy, np. macica dwurożna, mała macica, mała miednica, guzy macicy (mięśniaki, włókniaki), małowodzie, nieprawidłowe ułożenie płodu, choroby ograniczające możliwości poruszania się płodu - zaburzenia neurologiczne, pierwotne choroby mięśni, wady stawów, zdeformowaniu ulegają najczęściej kości, stawy i chrząstki, po urodzeniu - widoczne w postaci (skręcenia lub skrzywienia kości, ograniczenia ruchomości stawów, spłaszczenia nosa i uszu), większość deformacji podlega samoistnemu odkształceniu w ciągu kilku miesięcy lub lat, sekwencja deformacyjna - gdy ucisk mechaniczny wywołuje wiele deformacji, np. sekwencja Potter
sekwencja Potter: agenezja nerek, małowodzie, ucisk wewnątrzmaciczny (deformacje wygięciowe kończyn, przykurcze stawowe, „twarz Potter”)
Zespół Crouzona: najczęstsza kraniosynostoza, charakteryzuje się przedwczesnym zarośnięciem szwów wieńcowych i hipoplazja środkowej części twarzy z uwypukleniem czoła, początek w 1 rż, zarośnięcie szwów - 3rż, spłycenie oczodołów, uwypuklenie gałek ocznych, przewlekłe zapalenia spojówek i rogówek, niedosłuch przewodzeniowy, nie stwierdza się wad kończyn, AD, mutacje FGFR2
Zespół Aperta (acrocephalosyndaktylia): zaburzenie zarastania wszystkich szwów czaszkowych, poza szwem węgłowym, wysoka czaszka ze zmniejszonym wymiarem przednio-tylnym, płaska środkowa część twarzy, wyraźnie zaznaczone bruzdy nadoczodołowe,płytkie oczodoły, skośno-dolne ustawienie szpar powiekowych, syndaktylia „rękawicowa” (2,3 i 4 palca), bloki kostne kręgów szyjnych, opóźnienie rozwoju psychoruchowego - u większości, AD, mutacje FGFR2
Zespół Pfeiffera: charakterystyczna - kranosynostoza szwu wieńcowego , niekiedy - strzałkowego, brachycefalia, wysokie czoło, hiperteloryzm, mały nos z pogłębioną nasadą, szerokie kciuki i paluchy, częściowa syndaktylia 2 i 3 palców dłoni oraz 2,3 i 4 palców stóp
dystrupcje (przerwania) - wady wynikające z zaburzenia prawidłowego dotychczas rozwoju danego układu lub narządu. są wadami morfologicznymi wynikającymi z przerwania lub zakłócenia pierwotnie prawidłowego procesu rozwojowego, w przeciwieństwie do deformacji - nie sa wyłącznie skutkiem działania sił mechanicznych, ale mogą być wywołane przez niedokrwienie, wylew krwi lub zrosty tkankowe, mogą być skutkiem działania czynnika teratogennego lub pojawiać się z nieznanej przyczyny, występują sporadycznie ( w przeciwieństwie do deformacji, malformacji i dysplazji), sekwencja przerwania - jeśli czynnik wywołujący przerwanie powoduje wiele defektów
zespół pasm owodniowych: przerwanie dotyczy różnych tkanek, lokalizacja uszkodzenia nie odpowiada określonym granicom anatomicznym embriogenezy
dysplazje - są to stany, w których nieprawidłowa organizacja lub czynność komórek określonej tkanki ustroju prowadzą do zmian budowy ujawniających się klinicznie, większość dysplazji - choroby monogenowe (dysplazje kostne, dysplazje ektodermalne, wrodzone defekty kolagenu, choroby spichrzeniowe), wyjątkiem dysplazji niegenetycznego pochodzenia - odpryskowce (hamartoma), t.j. naczyniaki i znamiona, zmiany dysplastyczne mogą nasilać się przez całe życie
dysplazja tanatoforyczna: znacznego stopnia skrócenie kończyn, wąska, „gruszkowata” klatka piersiowa, hipotonia mięśniowa, brak odruchów ścięgnistych, wypukłe czoło, płaska nasada nosa, wytrzeszcz gałek ocznych, deformacja czaszki w kształcie liścia koniczyny (Kleeblattschadel)
achondroplazja: skrócenie odcinków bliższych kończyn, duża głowa z wydatnymi guzami czołowymi, niedorozwojem szczęk i prognacją żuchwy, niski wzrost, krótkie i szerokie dłonie, opóźnienie rozwoju motorycznego
zespół Marfana: arachnodaktylia, szczupła sylwetka, klatka piersiowa szewska lub kurza, skolioza, lordoza piersiowa, gotyckie podniebienie, zwichnięcie soczewek, krótkowzroczność, ew. niebieskie twardówki, wypadanie płatka zastawki dwudzielnej/niedomykalność, poszerzenie części wstępującej aorty/rozwarstwienie aorty
Typy wad wrodzonych:
wady duże: wady, które upośledzają czynność ustroju lub skracają życie, np. zespół Downa, rozszczep wargi, zaćma, przerostowe zwężenie odźwiernika, 2-3% noworodków
wady małe (anomalie): z reguły mają znaczenie kosmetyczne, są pomocne w rozpoznawaniu zespołów, mogą być wskazówką, że istnieją inne, większe zaburzenia morfogenez, większość małych wad to malformacje, występują najczęściej na obszarach o złożonej budowie, t.j twarz, dłonie
przykłady małych anomalii: wyrośla na kości potylicznej, dołki, wyrośla przeduszne, hiperteloryzm, różnobarwność tęczówek, ubytek tęczówek, zmarszczka nakątna, rozdwojony języczek, klinodaktylia V palca, syndaktylia, pojedyncza bruzda zgięciowa dłoni, dodatkowe wiry włosów, biały kosmyk, plamy „cafe au lait”, spodziectwo
Skojarzenia wad wrodzonych:
są to nielosowe połączenia wad, których poszczególne składowe występują razem częściej, niż mogłyby występować przypadkowo
np. skojarzenie VACTERL (Vartebral anomalies, Anal atresis, Cardiac abnormalities, Tracheo-Esophageal fistula, Renal abnormalities, Limb abnormalities)
Sekwencje wad:
oznaczają, że jeden podstawowy defekt wywołuje kaskadę zmian strukturalnych, które wydają się nie być ze sobą powiązane
pierwotny defekt jest najczęściej malformacją
przykłady: sekwencja Pierre-Robin, sekwencja otwartej wady cewy nerwowej, sekwencja skąpowodzia (Potter)