Immunologia - prelekcja 8.10.2007

Podział odporności:

ODPORNOŚĆ

Humoralna Komórkowa

Swoista	Wrodzona	Swoista	Wrodzona
Limfocyty B Przeciwciała	CRP Lizozym etc.	Limfocyty T APC	Fagocytoza Kom. NK

Budowa immunoglobulin

IgA, IgG, IgD posiadają trzy regiony C_H i region zawiasowy (ang. „hinge region”), natomiast IgM i IgE - cztery regiony C_H.

IgM, IgA, IgD posiadają w łańcuchu ciężkim strukturę „ogonka”.

Fragment Fab służy wiązaniu antygenu, natomiast Fc pełni funkcje efektorowe i transportowe.

Obraz domeny to pętla złożona z ok. 110 aminkowasów.

IgA w wydzielinach przeważa jako forma dimeryczna, w surowicy natomiast jako forma monomeryczna.

Właściwości immunoglobulin

	IgG	IgA	IgM	IgD	IgE
Masa cz. x10^3	150	160	970 (5 x 194)	185	190
Liczba cz. cztero łańcuchowych	1	1,2	5	1	1
Łańcuch ciężki	γ	α	μ	δ	ε
Łańcuch lekki	κ lub λ	κ lub λ	κ lub λ	κ lub λ	κ lub λ
Wartościowość dla antygenu	2	2,4	5-10	2	2
Stężenie w surowicy	8-16 mg/ml	1-4,4 mg.ml	0,5-2 mg/ml	0-0,04 mg/ml	5*10^-9 mg/ml
% Ig surowicy	80	13	6	0-1	0,002
Wiązanie dopełniacza	++	-	+++	-	-
Przechodzenie przez łożysko	++	-	-	-	-
Wiązanie z kom. tucznymi i neutrofilami	-	-	-	-	+
Wiązanie z monocytami i makrofagami	++	-	-	-	-
Czas półtrwania (dni)	23	5,5	15	2,8	2
Występowanie w mleku	+	+	0-ślad	-	-

Właściwości podklas IgG

	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
% całkowitego IgG	43-75	16-48	1,7-7,5	0,8-11,7
Przechodzenie przez łożysko	+	+	+	+
Ag białkowe	++	+/-	++	+/-
Ag polisacahrydowe	+	++	(-)	(-)
Alergeny	+	(-)	(-)	+
Akt dopełniacza	++	+	+++	(-)

Łączenie się IgG z docelowymi komórkami

• Fcγ RI (CD64): monocyty, makrofagi, neutrofile, kom. dendrytyczne

• Fcγ RII (CD32): monocyty, makrofagi, neutrofile, eozynofile, trombocyty, limf. B, kom. dendrytyczne, kom. endotelialne

• Fcγ RIII (CD16): neutrofile, eozynofile, makrofagi, komórki NK, limf. T

Markery antygenowe immunoglobulin

Izotypy - występowanie Ig z uwględnieniem zróżnicowania w budowie łańcuchów ciężkich i lekkich, umożliwiające podział na klasy i typy.

Allotypy - występowanie różnic w obrębie części stałych łańcuchów ciężkich i lekkich (głównie ciężkich) różnych aminokwasów w określonych pozycjach łańcucha peptydowego.

Idiotypy - występowanie różnic w obrębie części zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich.

Przeciwciała monoklonalne - są to przeciwciała o tym samym izo-, allo- oraz idiotypie, produkowane przez ten sam klon limfocytów B i plazmocytów. Możemy dzięki nim otrzymywać w dużych ilościach przeciwciała o dużej swoistości. W tym celu immunizujemy zwierzę, np. mysz danym antygenem, po czym łączymy jej limfocyty B z komórką szpiczaka (nowotworu pochodzącego z szeregu rozwojowego limfocytów B), w której brak HGRPTazy. Zachodzi fuzja tych dwóch komórek, wskutek czego otrzymujemy hybrydy - komórki hybridoma. Następnie oczyszczamy hybrydę z komórek szpiczaka stosując medium HAS (hipoksantyna-aminopterydyna-tymidyna) przez co zabijamy komórki nowotworowe - hybrydy mają HGPRTazę dzięki czemu przeżywają. Następnie przeprowadzamy testy swoistości wobec antygenu przeciwko któremu dane próbki komórek hybridoma produkują przeciwciała. Po uzyskaniu odpowiednio swoistego klonu możemy go namnażać in vitro bądź in vivo. Limfocyt B określa swoistość hybrydy, natomiast szpiczak jako „motor napędowy” nadaje jej „nieśmiertelność” i dostarcza rybosomów i aparatu Golgiego niezbędnego do syntezy białek.

Zastosowanie przeciwciał monokolonalnych:

• diagnostyka mikrobiologiczna chorób zakaźnych

• oznaczanie stężeń białek i leków w płynach ustrojowych

• typowanie tkanek i krwi

• diagnostyka nowotworów, białaczek, chłoniaków, chorób autoimmunologicznych

• ocena układu odpornościowego

• oznaczanie stężenia hormonów

• terapia - uwaga na HAMA - human anti-mouse antibodies, p/ciała wytwarzane przez nasz organizm przeciwko białkom pochodzącym bądź co bądź z mysich komórek

Preparaty immunoglobulinowe:

• ludzkie

• obcogatunkowe

• chimerowe - 33% mysie (od strony Fab) + 67% ludzkie

• humanizowane, 5-10% mysie (od strony Fab), reszta ludzka

Stosowane preparaty immunoglobulinowe:

• Ig ludzkie nieswoiste - od osób nieimmunizowanych (zlewanie surowicy od minimum 1000 dawców i pobieranie z niej przeciwciał) - leczenie pierwotnych i wtórnych niedoborów odpornościowych typu humoralnego, zakażeń bakteryjnych i wirusowych zagrażających życiu, profilaktyka WZW typu A i odry.

• Ig ludzkie swoiste (o wysokiej zawartości przeciwciał) - przeciw HBV (antygen HBSPa), VZV (odra, półpasiec), wirusowi kleszczowego zapalenia mózgu, wirusowi wścieklizny, CMV (cytomegalia), toksynie tężcowej, Ig anty Rh

Mogą to być Ig chimerowe lub humanizowane. Przykłady:

Immunoglobulina	Skład	Wskazania
anty TNF-alfa	chimerowe	terapia RZS, choroby Crohna, colitis ulcerosa
anty HER 2	humanizowane	terapia raka piersi z przerzutami
przeciwko receptorowi aktywnych płytek krwi (GP IIb/IIIa)	chimerowe	terapia i profilaktyka ostrych stanów niedokrwiennych serca
przeciwko receptorowi CD20	humanizowane	leczenie chłoniaków pochodzących z limfocytów B
anty CD 52	humanizowane	przewlekła białaczka limfocytarna
anty IgE	humanizowane	nadwrażliwość typu I
przeciwko receptorowi CD25 (IL-2R)	humanizowane	profilaktyka ostrego odrzucenia przeszczepu
anty CTLA4	humanizowane	terapia RZS, melanoma

CTL4 - powstaje podczas aktywacji limfocytów T. Po zadziałaniu na CTL4 klon limfocytów T ulega delecji.

Odczyn precypitacji

Jest to odczyn w którym antygen jest w postaci rozpuszczonej, w przeciwieństwie do aglutynacji gdzie jest upostaciowiony. Charakteryzuje go mniejsza czułość niż aglutynację. Wymaga udziału wielowartościowego antygenu i co najmniej dwuwartościowego przeciwciała tak jak w aglutynacji. Musi być także zachowany odpowiedni stosunek antygen:p/ciało, ponieważ reakcja najlepiej zachodzi w strefie ekwiwalencji ilościowej ich stężeń. W strefie nadmiaru antygenu bądź przeciwciała tworzą się rozpuszczalne kompleksy immunologiczne.

Podział precypitacji:

• W środowisku płynnym - USR, VDRL stosowane w screeningu kiły (nie musi być swoisty, ale czuły, bowiem dodatni wynik zawsze weryfikujemy).

• W środowisku półpłynnym

• Immunodyfuzja podwójna

• Immunodyfuzja pojedyncza

• Immunoelektroforeza

• Western-blot

• Nefelometria

• Turbidymetria

Percypitacja w środowisku płynnym

Metody te są głównie jakościowe. Zalicza się do nich np. wykrywanie antygenów Baccillus antracis w skórach i innych tkankach zwierzęcych - tzw. odczyn Ascoliego. Antygen jest ekstrahowany z tkanki, po czym przeprowadza się reakcję surowicy odpornościowej z roztworem zawierającym antygen. Powstanie pierścienia precypitacyjnego oznacza wynik dodatni.

Odczyny nieswoiste - USR, VDRL - stosujemy w screeningowej serodiagnostyce kiły. Poszukiwanym antygenem są reaginy kiłowe. Są to tzw. odczyny kłaczkujące. Ponieważ jest to metoda screeningowa, aby potwierdzić wynik pozytywny musimy w następnej kolejności przeprowadzić swoisty test TPHA.

Immunodyfuzja podwójna (metoda Otcherlonyego)

Jest to metoda pozwalająca określić stopień pokrewieństwa antygenów

W przypadku gdy oba antygeny (oznaczone A) są identyczne linia precypitacyjna ma kształt łuku, gdy są częściowo identyczne - łuku z ostrogą, gdy są różne - są to dwie przecinające się proste linie.

Do metod immunodyfuzji podwójnej zalicza się także test Elecka, służący badaniu toksyczności maczugowca błonicy - nie wszystkie szczepy tej bakterii są toksyczne. Przeciwciało przeciwko toksynie maczugowca umieszczamy na bibułce filtracyjnej, a prostopadle do niego nanosimy bakterie. Tworzenie „wąsów precypitacyjnych” oznacza że dany szczep jest toksyczny.

Immunodyfuzja pojedyncza (immunodyfuzja radialna, metoda Mancini)

Metoda ta znalazła zastosowanie w ilościowym oznaczaniu stężenia immunoglobulin w surowicy, a także składników dopełniacza (C3, C4) oraz niektórych białek ostrej fazy (transferyna, laktoferyna).

Polega ona na umieszczeniu w specjalnym krążku przeciwciała - w otworach w żelu agarozowym oraz poszukiwanego antygenu - w centrum krążka w baseniku. Antygen dyfunduje radialnie w żelu zawierającym przeciwciało, a gdy wyczerpie się jego zapas powstaje w tym miejscu pierścień precypitacyjny, którego szerokość oceniamy porównując średnicę otrzymanego pierścienia z pierścieniami wzorcowymi (wykonujemy równolegle 3-4 standardy) otrzymanymi przez użycie wzorcowego antygenu:

Wadą tej metody jest dość długi czas reakcji (24-48 h) oraz spory błąd pomiarowy (10- 15%) - sami wykonujemy wzorce kalibracyjne.

Immunoelektroforeza

Jest to metoda jakościowa i półilościowa, oceniamy łuki precypitacyjne, prowadzimy ją na szkiełku pokrytym żelem. Po wycięciu otworów dla surowic (badanej i kontrolnej) najpierw zachodzi elektroforeza białek, a po niej wycinamy rowki do których dodajemy p/ciała - zachodzi immunoprecypitacja. Po wybarwieniu interpretujemy wynik.

Immunoelektroforeza wg Grabara jest metodą półilościową, pozwalającą na diagnozę hiper-, nipo- bądź agammaglobulinemii. Stosujemy tu surowicę badaną i kontrolną wg. powyższego opisu. Aby zdiagnozować w/w gammapatie porónujemy obraz prawidłowej surowicy kontrolnej oraz surowicy pacjenta.

Immunoelektroforeza służy także diagnozowaniu szpiczaka mnogiego, gdzie za pomocą swoistych przeciwciał wykrywamy i identyfikujemy białko monoklonalne, używając jako odniesienia odpowiedniego wzorca.

Elektroforeza przeciwprądowa - można ją przeprowadzić gdy antygen i przeciwciało mają przeciwne ładunki, sprawiamy że migrując do przeciwnych elektrod jednocześnie migrują one „do siebie” w trakcie elektroforezy. Jest to rzadko stosowana metoda używana głównie w celach naukowych.

Western-blot

Metoda ta służy do wykrywania antygenu i przeciwciała, częściej przeciwciała, głównie w diagnostyce zakażeń wirusem HIV - screeningowo wykonujemy test metodą ELISA obarczony sporym błędem pomiarowym (wyniki fałszywie dodatnie), Western-blot służy potwierdzeniu wyniku. Często używa się sonifikowanego (rozbitego ultradźwiękami) wirusa, któego fragmenty służą jako wzorcowe antygeny „wyłapujące” przeciwciała w surowicy krwi. Powstałe kompleksy immunologiczne wykrywamy surowicą antyglobulinową sprzężoną z enzymem - oznaczamy stężenie produktu reakcji enzymatycznej.

Techniką tą możemy także wykrywać antygen, co zostało wykorzystane w diagnostyce zakażenia prionami w BSE. Zasada metody polega na denaturacji białek proteazami, na które wrażliwy jest nawet obecny fizjologicznie w komórkach prion. Trawieniu nie podlegają jedynie priony chorobotwórcze, które następnie wykrywane są za pomocą swoistych przeciwciał.

Zastosowanie także w diagnostyce boreliozy, serodiagnostyce HCV które często przebiega bezobjawowo dając powikłania w postaci raka lub marskości wątroby, a także zakażenia Helicobacter pylori, jedynego bakteryjnego karcynogenu klasy I - rozłożone elektroforetycznie antygeny H. pylori (w tym CAK-2) wiążą się ze swoistymi przeciwciałami.

Nefelometria

Jest to metoda ilościowego oznaczania białek polegająca na pomiarze natężenia światła rozproszonego w roztworze zawierającym kompleksy immunologiczne. Zaletą metody jest łatwość i krótki czas wykonania. Zastosowanie diagnostyczne: oznaczanie immunoglobulin (G, A, M), składowych dopełniacza (C3, C4), białek ostrej fazy (alfa1-IP, ceruloplazmina, CRP), albuminy.

Turbidymetria

Jest to metoda ilościowego oznaczania białek polegająca na pomiarze spadku natężenia światła po przejściu przez zawiesinę zawierającą kompleksy immunologiczne. Zastosowanie diagnostyczne: oznaczanie immunoglobulin, składowych dopełniacza, białek ostrej fazy.

Class switching

Jest to zjawisko zachodzące w limfocytach B podczas odpowiedzi zależnej od limfocytów T. Limfocyt B dziewiczy posiada jako receptory IgM oraz IgA. Część zmienna łańcucha ciężkiego każdej z immunoglobulin kodowana jest przez geny VDJ, natomiast część stała zostaje do niej dołączona później - w każdej immunoglobulinie część stałą koduje inny zestaw genów; są one ułożone kolejno po sobie, tak że na początku zawsze syntetyzowana jest IgM, a potem kolejno: ... W obrębie genów VDJ w limfocytach B zachodzą mutacje somatyczne co wzmaga swoistość receptorów czyli IgM wobec antygenu. Zachodzą one jednak losowo, przez co organizm wypracował sobie pewien system selekcji najbardziej swoistych limfocytów B. Kolejne populacje tych komórek łączą się z antygenem na wypustkach dendrytycznych komórki prezentującej antygeny - przeżywają tylko te które najsilniej się z nią zwiążą. Class switching jest regulowany przez limfocyty T w zakresie rodzaju produkowanego przeciwciała, a każda kolejna z w/w klas ma większe powinowactwo do antygenu niż poprzednia.

---