ĆWICZENIE X

Temat I: Udział drobnoustrojów w obiegu węgla w przyrodzie c.d.

1. Drobnoustroje celulolityczne

Bakterie celulolityczne obserwowane na ćwiczeniach

Cellulomonas (rodzaj) - pałeczki lub formy nitkowate lub komórki kokoidalne (maczugowce) o długości 0,7 - 2,0 µm, nieruchliwe bądź ruchliwe, gram ⁺. Tlenowce lub względne beztlenowce. Metabolizm oddechowy lub fermentacyjny. Chemoorganoheterotrofy. Rozkładają skrobię i celulozę. Występują w glebie. Gatunek typowy C. trachomatis.

Cytophagaceae (rodzina) - komórki wydłużone, czasami ostro zakończone, pełzające, gram¯. Niektóre tworzą formy przetrwalne  podobne do mikrocyst bakterii śluzowych. Rosnące tlenowo. Liczne formy rozkładają błonnik. Środowisko - gleba wyjątkowo woda.  Bakterie najłatwiejsze do wyizolowania z hodowli wzbogacającej na podłożu płynnym jest Cytophaga, Sporocytophaga - tworzy mikrocysty (ok 1,5 µm, silnie barwiące się). 

rys. wg. Schlegela

 

Inne mikroorganizmy rozkładające celulozę

Eukariota	Prokariota
Aspergillus fumigatus Aspergillus nidulans Botrytis cinerea Chaetomium globosum Fusarium Trichoderma viride	Pseudomonas fluorescenes var. cellulosa Cellvibrio flavescens Clostridium thermocellum Clostridium cellobioparum Bacteroides succinogenes

Część praktyczna

a). Obserwacja makroskopowa tlenowych hodowli mezofilnych drobnoustrojów celulolitycznych w pożywce płynnej i podłożu stałym. 

Hodowle na podłożu stałym	Hodowle na podłożu płynnym
Można zaobserwować obecność śluzowych koloni oraz zmianę barwy bibuły na żółto-pomarańczową.	Bibuła częściowo zhydrolizowana i widoczna obecność żółtych barwników.

b). Obserwacja mikroskopowa tlenowych, mezofilnych drobnoustrojów celulolitycznych w preparacie barwionym metodą prostą (fioletem goryczkowym) - powiększenie 1250x.

• Na szkiełko podstawowe nanosimy małą kroplę wody a następnie wyżarzoną ezą pobieramy z płytki Petriego barwne, śluzowe kolonie. Materiał rozcieramy. Pozostawiamy do wyschnięcia a następnie utrwalamy nad płomieniem. Preparat barwimy metodą prostą. Utrwalony, ostudzony preparat zalewamy fioletem goryczkowym. Barwnik spłukujemy wodą po ok. 2 min. i preparat suszymy . Preparat oglądamy pod powiększeniem 1250x.

Rysunek z opisem z obserwacji mikroskopowej

• Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę wody a następnie pobieramy wyżarzoną ezą  kawałek zabarwionej bibuły z hodowli płynnej. Preparat pozostawiamy do wyschnięcia, a następnie utrwalamy nad płomieniem i barwimy metodą prostą. Utrwalony, ostudzony preparat zalewamy fioletem goryczkowym. Barwnik spłukujemy wodą po ok. 2 min. i suszymy preparat. Preparat oglądamy pod powiększeniem 1250x.

Rysunek z opisem z obserwacji mikroskopowej

2. Bakterie fototroficzne

Zdolność wykorzystania światła jako źródła energii do wzrostu posiadają bakterie fototroficzne. Bakterie fotosyntetyzyjące dzielimy na: 

• sinice i Prochlorales,

• bakterie zielone (Chlorobiaceae, Chloroflexaceae, Heliobacteriaceae),

• bakterie purpurowe siarkowe (Chromatiaceae)

• bakterie purpurowe bezsiarkowe (Rhodospirillaceae)

Sinice

Grupa bakterii zróżnicowana morfologicznie. Zawierają one chlorofil a taki jak rośliny natomiast zamiast chlorofilu b występują u nich fikobiliny. Wiążą CO₂ w cyklu Calvina. Sinice są pospolite i często występują w wodach słodkich i morzach, a także w glebach i na wilgotnych skałach.

Prochlorales - zawierają chlorofil a i b taki jak rośliny 

Bakterie zielone 

• Chlorobiaceae - drobne, krótkie, owalne pałeczki (0,7-0,9 x 1,5 µm), nieruchliwe i nieprzetrwalnikujące. Bezwzględne beztlenowce bezwzględnie autroficzne. Zawierają bakteriochlorofil o typie Chlorobium.  (Chlorobium, Clathrochloris - pałeczki zawierające siarkę, Pelodictyon - nieruchliwe, rozgałęzione pałeczki ułożone jak sieć, nie zawierające siarki)

• Chloroflexaceae - przedstawiciel Chloroflexus aurantiacus - pełzająca nitkowata bakteria zielona. Może rosnąć jako heterotrof w warunkach tlenowych i w ciemności

• Heliobacteriaceae - brązowozielone anoksygenne fototrofy, zawierające tylko u nich spotykany bakteriochlorofil g. Beztlenowo rosną fototroficznie i nie oddychają, są względnymi autotrofami, zużywając do wzrostu heterotroficznego tylko mleczany i pirogroniany. (Heliobacterium - pełzające pałeczki, Heliobacillus - urzęsiona ruchliwa pałeczka) 

Purpurowe bakterie siarkowe (Chromatiaceae)

Należą tu bakterie o niejednolitej przynależności systematycznej: Chromatium - bez wakuoli gazowych, zawierający siarkę w komórce; Thiospirillum - spiralne pałeczki, Thiocapsa i Thiopolycoccus - kuliste, polarnie urzęsione komórki, Ectothiorhodospira - spiralna komórka polarnie urzęsiona, gromadząca siarkę pozakomórkowo; Lamprobacter - pałeczki wyposażone w wakuole gazowe; Lamprocystis - kuliste urzęsione komórki; Thiodictyon - nieruchliwe pałeczki, stykające się ze sobą.

Bakterie te zawierają bakteriochlorofil, ale barwa jego jest zamaskowana przez brązowe i czerwone karotenoidy, Są to beztlenowce, prawie wszystkie poruszają się za pomocą polarnie umieszczonych rzęsek. Donorem elektronu są dla nich siarkowodór, siarka i wodór. Przy dużej zawartości siarkowodoru w podłożu utleniają go do siarki i często gromadzą ją wewnątrzkomórkowo w postaci kropelek. Po wyczerpaniu siarkowodoru zaczynają utleniać siarkę. Głównym źródłem pożywienia jest CO₂, a źródłem energii - promieniowanie świetlne. Bakterie purpurowe siarkowe są również zdolne do wiązania azotu cząsteczkowego. 

Purpurowe bakterie bezsiarkowe (Rhodospirillaceae) 

Znane obecnie purpurowe bakterie bezsiarkowe zalicza się do 5 rodzajów:

• rodzaj Rhodospirillum - bakterie spiralne - Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum fulvum, 

• rodzaj Rhodopseudomonas - bakterie pałeczkowate - Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas viridis, 

• rodzaj Rhodobacter - bakterie pałeczkowate - Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sulfidophilus,

• rodzaj Rhodocyclus - zakrzywione pałeczki - Rhodocyclus purpureus, Rhodocyclus tenuis

• rodzaj Rhodopila - bakterie o kształcie zbliżonym do kulistego -  Rhodopila globiformis

Są to nieprzetrwalnikujące ruchliwe formy, zaopatrzone w biegunowo ułożone rzęski (odmienną budową odznacza się jedynie Rhodomicrobium vannielii). Bakterie te mają bakteriochlorofil i barwniki karotenoidowe. Mogą się odżywiać autotroficznie, gdy znajdują się na świetle w warunkach beztlenowych lub heterotroficznie gdy rosną w obecności tlenu i przy braku światła. Przeprowadzając fotosyntezę wykorzystują jako donory wodoru różne związki organiczne. Niektóre mogą też w tym wykorzystywać siarkowodór, siarkę i wodór. Bakterie te przeniesione do warunków tlenowych natychmiast przestają syntetyzować bakterio chlorofil, przestawiają swój metabolizm z fotosyntezy na odżywianie heterotroficzne i zaczynają asymilować i utleniać jako substrat oddechowy te same związki organiczne, które służyły jako donory wodoru w procesie fotosyntezy. Wskutek wstrzymania syntezy barwników bakterie stają się bezbarwne. W ciemności zatem zachowują się jako typowe heterotrofy, stają się wówczas bezwzględnymi aerobami. Po ponownym przeniesieniu do warunków beztlenowych  i naświetleniu zaczynają syntetyzować bakteriochlorofil i powracają do fototroficznego trybu życia. Bakterie purpurowe bezsiarkowe są również zdolne do wiązania azotu cząsteczkowego. 

A) Rhodospirillum rubrum	B) Rhodospirillum fulvum

fot. wg Schlegela

Część praktyczna

Obserwacja hodowli purpurowych bakterii bezsiarkowych (fotoorganotrofy) - demonstracja

 Można zaobserwować ciemnoczerwone zabarwienie wywołane produkowanymi przez Rhodospirillum rubrum barwnikami z grupy karotenoidów. Osad zlokalizowany z jednej strony probówki (od strony naświetlania hodowli) 

Temat II: Udział drobnoustrojów w obiegu azotu w przyrodzie 

Azot, podstawowy pierwiastek biogenny, występuje w przyrodzie w bardzo dużych ilościach. Azot cząsteczkowy /N₂/ jest głównym składnikiem atmosfery. W związkach organicznych azot dostaje się do gleby z resztkami roślin, obumarłymi ciałami zwierząt i odchodami. Źródłem azotowych związków w glebie są również nawozy mineralne. Różne grupy drobnoustrojów biorą udział w przemianach składających się na cykl krążenia azotu w przyrodzie.

Schemat cyklu krążenia azotu w przyrodzie

Na tym ćwiczeniu omówione zostanie niesymbiotyczne wiązanie azotu cząsteczkowego przez drobnoustroje wolno żyjące. Pozostałe ogniwa cyklu krążenia azotu w przyrodzie będą omawiane systematycznie przy kolejnych ćwiczeniach dotyczących udziału drobnoustrojów w obiegu azotu w przyrodzie  

Wiązanie azotu cząsteczkowego

Olbrzymia większość roślin zielonych nie jest zdolna do odżywiania się azotem cząsteczkowym. Wiązanie azotu cząsteczkowego odbywa się przy udziale bakterii wolno żyjących i tworzących układy symbiotyczne z roślinami. W wyniku działalności tych drobnoustrojów N₂ zostaje wbudowany w organiczne składniki komórkowe.

1. Tlenowe drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy

Tę grupę drobnoustrojów poznamy na przykładzie bakterii z rodzaju Azotobacter. W celu odizolowania przedstawicieli z rodzaju Azotobacter od innych drobnoustrojów glebowych i wyhodowania ich w czystej ku1turze (zawierającej tylko określony gatunek bakterii), bądź też w kulturze wzbogaconej (wybitna przewaga danego gatunku nad innymi), stosujemy pożywkę wybiórczą. Niemal wszystkie drobnoustroje glebowe pokrywają swoje zapotrzebowanie na azot kosztem związków azotowych. Azotobacter natomiast należy do drobnoustrojów mogących żyć i rozwijać się przy zupełnym braku azotu związanego, odżywiając się wyłącznie azotem cząsteczkowym. Ta zdolność określa podstawową właściwość pożywki wybiórczej, która może być zastosowana do wyizolowania Azotobactera: powinna to być pożywka bez związków azotu, a więc bezazotową. Dalsze elementy wchodzące w skład pożywki ustalamy również na podstawie znajomości fizjologii Azotobactera. Jest to drobnoustrój cudzożywny, wymagający w pożywce organicznego połączenia węgla (np. glukozy, mannitolu, octanu), wrażliwy na obecność dostatecznej ilości przyswajalnych związków fosforu i wapnia, nie znoszący środowiska zakwaszonego. W praktyce mikrobiologicznej stosuje się w hodowli Azotobactera pożywki o różnym składzie, uwzględniające jego wymagania.

Pożywka używana na ćwiczeniach zawiera roztwór soli mineralnych i glukozę jako źródło węgla i substrat energetyczny i jest to pożywka płynna. Aby uzyskać podłoże stałe, dodaje się do niej 1,5 - 2% agaru; pH gotowej pożywki powinno wynosić 7,0.

Wzrost Azotobactera jest na tyle charakterystyczny, że stosunkowo łatwo można go wyróżnić. Azotobacter wytwarza duże ilości śluzów. W glebach polskich bytuje głównie gatunek Azotobacter chroococcum, produkując melaninowy brunatny barwnik. Wzrost Azotobactera jest więc wyraźnie śluzowy i mniej lub więcej intensywnie brązowy (w starych hodowlach - czarny)

Identyfikacje Azotobactera nie nastręcza większych trudności. Są to przeważnie komórki duże, o charakterystycznym owalnym kształcie, występujące często w postaci dwoinek. W starszych hodowlach przeważają formy spoczynkowe Azotobactera - kuliste cysty. Mimo wybiórczości podłoża mogą się jednak rozwijać na nim również inne drobnoustroje wniesione wraz z glebą. Rozwój ich odbywa się kosztem ewantalnych azotowych zanieczyszczeń wniesionych z gleba, a przede wszystkim kosztem azotu związanego przez Azotobactera. Możemy też dostrzec przetrwalnikujece komórki Clostridium.

Część praktyczna

a). Zakładanie hodowli wzbogaconej Azotobactera w pożywce płynnej - każda para wysiewa grudkę gleby do kolbki z płynną pożywką bezazotową.

b). Zakładanie hodowli wzbogaconej Azotobactera na podłożu stałym - każda para wysiewa 12 małych grudek gleby na płytkę Petriego ze stałym podłożem bezazotowym. Płytki i kolbki wstawiamy do cieplarki o temp. 28^oC.

2. Beztlenowe drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy.

W glebie znajdują się również bakterie wolno żyjące wiążące azot atmosferyczny w warunkach beztlenowych należące do gatunku Clostridium pasteurianum. Aby ujawniły się charakterystyczne produkty przemiany materii oraz aby było możliwe uzyskanie na wybiórczej pożywce bezazotowej wzrostu umożliwiającego obserwację mikroskopową trzeba doprowadzić do masowego rozwoju Clostridium pastsurianum w badanej glebie. Metodę, polegajacą na doprowadzeniu do masowego rozwoju określonej grupy drobnoustrojów w macierzystej glebie, pod wpływem uzupełniania tej gleby odpowiednimi składnikami pokarmowymi, nazywamy metodą hodowli naturalnych albo spontanicznych. Cloatridium pasteurienum ma wymagania pokarmowe zbliżone do wymagań Azotobactera. Wybiórczość pożywki polega więc i w tym wypadku na wyeliminowaniu związków azotu. Dodatkowym, bardzo istotnym elementem selekcjonującym jest uniemożliwienie dostępu tlenu gdyż Clostridium pasteurienum jest beztlenowcem bezwzględnym. Koniecznym składnikiem pożywki jest także organiczny związek węgla. O obecności w hodowli Clostridium świadczy wytwarzanie gazu i zapach kwasu masłowego (produkty fermentacji masłowej).

Część praktyczna

a). Zakładanie hodowli Clostridium pasteurianum na wzbogaconej pożywce płynnej - wysiewamy glebę (ok. 1cm³) do płynnej pożywki bezazotowej, a następnie w celu pasteryzacji pożywkę zaszczepioną glebą umieszcza się w łaźni wodnej o temp. ok. 75^oC na 10 minut. Probówki wstawiamy do cieplarki do temp 28^oC. Zabieg ten zwany pasteryzacją zmniejsza liczbę żywych wegetatywnych komórek różnych drobnoustrojów znajdujących się w glebie Clostridium jest bakterią przetrwalnikujacą. Przetrwalniki Clostridium wytrzymują ogrzewanie i po przeniesieniu szczelnie zakorkowanych probówek do cieplarki przekształcają się w postać wegetatywną, rozmnażającą się w warunkach bez dostępu tlenu, wytworzonych w wysokim słupie pożywki.

b). Zakładanie naturalnej hodowli Clostridium pasteurianum - w glebie wzbogaconej 2% roztworem sacharozy. Przygotowujemy hodowlę naturalną Clostridium pasteurianum. Studenci mieszają glebę z 2 % roztworem sacharozy aby otrzymać plastyczną masę. Mieszaninę gleby z cukrem wprowadzamy do probówek dobrze ubijając. Hodowle wstawiamy do cieplarki do temp. 28^oC.

• Wyliczenie % drobnoustrojów rozkładających skrobię.

---