Laboratorium Przyrodnicze: Chemia

Sprawozdanie z ćwiczeń z dnia 11.04.2014

Ćw. 1: SEPARACJA BARWNIKÓW ROŚLINNYCH METODAMI CHROMATOGRAFICZNYMI

Przyroda II rok

11.04.2014

1. Wstęp teoretyczny

1. Barwniki roślinne w liściach szpinaku - chlorofil

Liście szpinaku są bogate w różne barwniki takie jak: chlorofile a i b, feofityny a i b, kasntofile oraz karoten. Zielony kolor chlorofili jest wynikiem silnej absorpcji światła w określonym zakresie czerwonej i niebieskiej części widma widzialnego, zaś słabiej w zielonej.

Zielone barwniki roślinne występują w chloroplastach komórek odpornych w żywej tkance na działanie kwasów organicznych, tlenu i światła. Chlorofil jest bardzo trwałym barwnikiem, nie rozpuszcza się w wodzie, lecz w alkoholu. Zawartość chlorofilu w zielonych owocach i warzywach wynosi najczęściej od kilku do kilkudziesięciu mg w 100 g świeżego produktu. Najwięcej zawierają go: jarmuż, brokuły, szpinak, groch zielony, liście selera i pietruszki, jabłka oraz agrest. Chlorofil występujący w żywej tkance jest odporny na działanie czynników środowiskowych. Podczas obróbki cieplnej owoców i warzyw w środowisku kwaśnym chlorofil przekształca się w oliwkowozieloną feofitynę. Reakcja ta ma charakter nieodwracalny i jest tym intensywniejsza, im niższe jest pH, wyższa temperatura i dłuższy czas obróbki cieplnej.

2. Chromatografia i jej rodzaje

Pojęciem chromatografii obejmujemy techniki analityczne wykorzystujące zjawisko różnej szybkości migracji składników analizowanej mieszaniny. Różnica w szybkości migracji poszczególnych składników mieszaniny spowodowana może być przez różne czynniki - rozpuszczalność, współczynnik podziału, adsorpcje, reakcje chemiczne itp. - stąd podstawowy podział technik chromatograficznych na adsorpcyjne, podziałowe i jonowymienne.

Ze względu na rodzaje stosowanych faz dzielimy chromatografię na gazową (faza ruchoma jest gazem), cieczową grawitacyjną (fazą ruchoma jest ciecz przepływająca przez złoże fazy stacjonarnej pod wpływem siły grawitacji) i cieczową ciśnieniową (przepływ fazy wymuszony jest wysokim ciśnieniem wytwarzanym przez specjalne pompy). Inny podział wyróżnia techniki planarne (np. cienkowarstwowa lub bibułowa) i kolumnowe (faza stacjonarna wypełnia szklana lub metalową rurkę - kolumnę).

O chromatografii adsorpcyjnej mówimy wówczas, gdy głównym zjawiskiem determinującym przebieg procesu chromatograficznego jest zjawisko adsorpcji. Zjawisko to polega z głównej mierze na tym, że cząsteczka substancji łączy się w sposób nietrwały (głównie siłami o charakterze wiązania wodorowego) z powierzchnia adsorbenta (np. żel krzemionkowy). W chwili, gdy zaadsorbowana cząsteczka styka się z "czystą" fazą ruchomą następuje zjawisko desorpcji i cząsteczka przechodzi ponownie do fazy ruchomej.

2. Przebieg doświadczeń

1. Ekstrakcja szpinaku

Na początku odważyłyśmy ok. 1,2g mrożonego szpinaku, następnie po roztarciu w moździerzu oraz rozmrożeniu szpinaku się dodałyśmy 1,2g bezwodnego siarczanu magnezu i roztarłyśmy. Całość umieściłyśmy w zlewce o pojemności 100ml, następnie ekstrahowałyśmy 20ml acetonu w łaźni ultradźwiękowej przez 15 minut.. Po tym czasie do próbki dodałyśmy 8g bezwodnego siarczany sodu i odstawiłyśmy na bok na 7 minut. Po tym czasie zdekantowałyśmy ekstrakt, a następnie przesączyłyśmy go przez sączek do kolby okrągłodennej. Pozostały osad przemyłyśmy acetonem i powtórzyłyśmy proces dekantacji i sączenia celem połączenia obu ekstraktów. Ekstrakt umieściłyśmy w odparowywaczu obrotowym w temperaturze 24 stopni w celu odparowania acetonu, sam ekstrakt został zatężony do objętości ok. 0,5ml.

2. Chromatografia kolumnowa

4g żelu krzemionkowego umieściłyśmy w kolbie, następnie dodałyśmy 30ml roztworu eter naftowy- aceton w proporcji objętości 9:1. Po wymieszaniu pozostawiłyśmy całość na 5 minut. W międzyczasie umieściłyśmy kolumnę do chromatografii w statywie i zamknęłyśmy z niej odpływ. Na dnie kolumny umieściłyśmy niewielką ilość waty szklanej oraz krążek z bibuły (na wacie). Następnie wlałyśmy do kolumny 2ml roztworu eter naftowy-aceton (w proporcji objętości 9:1) i bagietką usunęłyśmy powietrze z waty. Po zainstalowaniu kolumny oraz usunięciu pęcherzyków powietrza z waty szklanej musiałyśmy wprowadzić powstałą zawiesinę żelu krzemionkowe do kolumny. Energicznie mieszałyśmy zawiesinę w kolbie, by następnie szybkim ruchem wlać całość do kolumny. Kolbę z osadem żelu krzemionkowego umieściłyśmy pod kolumną by spuścić z niej trochę roztworu - żel krzemionkowy pozostawał w kolumnie dzięki właściwościom filtracyjnym bibuły i waty szklanej. Czynność mieszania, wlewania żelu oraz zlewania roztworu powtórzyłyśmy kilkukrotnie tak, by uzyskać płaskie dno oraz płaski wierzch fazy stacjonarnej. Powierzchnia żelu była stale przykryta roztworem eter naftowy-aceton, stale kontrolowałyśmy stan cieczy tak, by nie dopuścić do przesuszenia żelu. Wysokość żelu w kolumnie zmierzyłyśmy i zanotowałyśmy.

W czasie instalowania i odparowywania ekstraktu przygotowałyśmy 3 roztwory 20ml niezbędne do wyodrębnienia barwników z ekstraktu szpinakowego:

1) roztwór A: eter naftowy-aceton w proporcji 9:1 (v:v),

2) roztwór B: eter naftowy-aceton w proporcji 7:3 (v:v),

3) roztwór C: aceton

Do kolumny delikatnie za pomocą pipety Pasteura wprowadziłyśmy połowę ekstraktu ze szpinaku, następnie otworzyłyśmy odpływ. Do fazy stacjonarnej wprowadzałyśmy próbkę przemywając 2-3 razy po 1ml roztworu A, aż do momentu, gdy znajdzie się w niej całość roztworu. Po skończeniu roztworu B wprowadziłyśmy kolejno roztwory B i C w ten sam, delikatny sposób. Do przygotowanych cylindrów zbierałyśmy powstające frakcje fazy ruchomej, zawierające wydzielone barwniki roślinne.

Objętości uzyskanych frakcji:

1- bezbarwna, V = około 5 ml,

2 - żołta, V = około 5 ml,

3 - bezbarwna, V = około 14 ml,

4 - jasnozielona, V = około 5 ml,

5 - zielona, V = około 10 ml,

6 - żołto-zielona, V = około 10 ml.

Wybrane frakcje - żółtą, zieloną oraz jasnozieloną zatężyłyśmy w odparowywaczu obrotowym do objętości po ok. 5ml i pozostawiłyśmy do analizy TLC.

3. Chromatografia cienkowarstwowa TLC

Komorę chromatograficzną napełniłyśmy fazą ruchomą w postaci 3ml roztworu eter naftowy-aceton w stosunku objętościowym 7:3, następnie zamknęłyśmy komorę na 10 minut by opary fazy wypełniły całą pozostałą objętość. W tym czasie na płytkach TLC narysowałyśmy delikatnie linię startową (0,8cm od dolnego brzegu płytki) oraz linię końcową (1cm od górnego brzegu płytki). Na linii startowej zaznaczyłyśmy 4 punkty, które w dalszej części doświadczenia były miejscem nanoszenia próbek ekstraktów.

Analizę TLC wykonałyśmy dla uzyskanych ekstraktów z wydzielonymi barwnikami oraz pozostałym ekstraktem ze szpinaku. Na płytkę TLC naniosłyśmy każdy ekstrakt w podobnej objętości - ok. 3-5μl tak, by żadna z plamek nie miała średnicy większej niż 5mm.

Punkt 1. Zatężona frakcja żółta

Punkt 2. Zatężona frakcja ciemnozielona

Punkt 3. Zatężona frakcja jasnozielona

Punkt 4. Zatężony ekstrakt z liści szpinaku

Płytkę z naniesionymi substancjami umieściłyśmy w komorze chromatograficznej tak, by dół płytki dotykał rozpuszczalnika w środku, zaś boki nie dotykały ścianek komory. Następnie zamknęłyśmy komorę i poczekałyśmy, aż rozpuszczalnik dotrze do linii końcowej narysowanej na płytce TLC. Następnie wyjęłyśmy płytkę, osuszyłyśmy i odrysowałyśmy widoczne plamki (Rysunek 1.)

Rysunek 1. Płytka TLC wraz z zaznaczonymi plamkami

3. Opracowanie pomiarów

1. Wyznaczanie współczynnika opóźnienia Rf dla ekstraktów szpinaku oraz barwników.

Współczynnik opóźnienia definiowany jest jako stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej od linii startu do środka plamki (B), do drogi przebytej przez czoło fazy ruchomej (A) (Rysunek 2.)

Rysunek 2. Schemat chromatografu TLC, źródło: http://wojciechzapala.sd.prz.edu.pl/

Wzór na współczynnik opóźnienia ma następującą postać:

A - odległość czoła rozpuszczalnika od linii startu (A=5,2cm)

B - odległość środka plamki danej substancji od linii startu

Ponieważ rozróżnić można było tylko 7 widocznych plamek tylko dla nich wyliczyłyśmy współczynnik opóźnienia. Pozostałe plamki zaznaczone na rysunku nie były na tyle widoczne w rzeczywistości by można w jednoznaczny sposób określić ich położenie. Wyniki dla kolejnych plamek przedstawiłyśmy w Tabeli 1.

Tabela 1.
Współczynniki opóźnienia Rf oraz zabarwienie związków
Nr ekstraktu	Kolor plamki		Związek	A [cm]	B [cm]	Rf
2	Żółto-szary		Ksantofile	5,2	2,6	0,50
3	Żółto-szary		Ksantofile	5,2	2,5	0,48
2	Ciemnozielony		Chlorofil a	5,2	2,9	0,56
3	Ciemnozielony		Chlorofil a	5,2	2,9	0,56
4	Intensywnie szary		Feofityna a	5,2	3,0	0,58
1	Intensywnie żółty		Karoten	5,2	5,1	0,98
4	Intensywnie żółty		Karoten	5,2	5,0	0,96

Analiza współczynników opóźnienia oraz kolorów uzyskanych plamek umożliwia nam dokonanie identyfikacji barwników zawartych w liściach szpinaku oraz w kolejnych ekstraktach uzyskanych metodą chromatografii kolumnowej.

Numer ekstraktu:

1. Zatężona frakcja żółta

2. Zatężona frakcja ciemnozielona

3. Zatężona frakcja jasnozielona

4. Zatężony ekstrakt z liści szpinaku

4. Wnioski

Okazuje się, że za barwę zielonego szpinaku nie odpowiadają jedynie chlorofile, ale także inne barwniki jak np. szara feofityna oraz inne żółte barwniki. Udało nam się wyodrębnić z ekstraktu szpinakowego raptem kilka występujących w nim barwników - ksantofile, chlorofil a, feofityna oraz karoten. Najdokładniejsze wartości Rf (0,1-0,7) osiągnęliśmy dla: ksantofilów (0,50 i 0,48), chlorofilów a (0,56 i 0,56) oraz dla feofityny (0,58). Barwnik „karoten” przekroczył normę Rf. Barwa była bardzo intensywna oraz plamka z wyizolowanego ekstraktu niemal idealnie pokrywała się w plamką karotenu „wzorca” (ekstraktem całego szpinaku). Plamki ciemnozielone i żółto-szare uzyskane dla prób 2 i 3 świadczą o tym, że zarówno w ekstrakcie o kolorze ciemnozielonym, jak i jasnozielonym zostały wyodrębnione ksantofile i chlorofile a. Rysunek plam uzyskany w punkcie 4 (ekstrakt szpinakowy) ukazuje nam gradient kolorów - widzimy tam wszystkie kolory ładnie przechodzące w następne i tylko żółtą oraz szarą plamkę można w jednoznaczny sposób wyizolować do badań. Obraz w punkcie czwartym świadczy, że w szpinaku odnajdziemy barwniki takie jak (patrząc od linii startowej) ksantofile, chlorofil b, chlorofil a, feofityna b, feofityna a, karoteny.

Z doświadczenia wynika, że barwa szpinaku jest mało trwała. Przyczynia się do tego zawartość chlorofilu w liściach. Po uszkodzeniu komórek roślinnych szpinaku działają na niego kwasy tkankowe. Dlatego też szpinak nie należy do warzyw, które można długo przechowywać, a raczej nadaje się on do szybkiej konsumpcji. Jedynym sposobem konserwacji tego warzywa jest zamrażanie. Alkalizacja środowiska pozwala na zachowanie jego zielonej naturalnej barwy, co prowadzi niestety do mazistości warzywa i zwiększenia strat witamin, które są rozpuszczalne w wodzie.

Zastosowanie szpinaku: Wszystkie gatunki szpinaku są spożywane, jednak tylko szpinak warzywny jest szeroko rozpowszechniony w uprawie i spożywany jako warzywo.

7

1 2 3 4

---