ĆWICZENIE I

Temat : Podstawowe wiadomości z techniki mikrobiologicznej.

• Zapoznanie z przepisami BHP.

Przedmiotem badań mikrobiologii rolniczej są mikroorganizmy zasiedlające glebę, powierzchnie roślin, komposty, obornik i inne nawozy organiczne. Badania te mają na celu charakterystykę ilościową i jakościową mikroorganizmów oraz określenie ich roli i aktywności w środowisku.

1. Podłoża hodowlane (typy i przykłady); substancje zestalające (agar - agar, żelatyna).

Hodowle drobnoustrojów prowadzi się na pożywkach lub podłożach hodowlanych. Pożywką nazywamy zestaw składników pokarmowych odpowiednio dobranych pod względem ilościowym i jakościowym niezbędnych do hodowli drobnoustrojów.

Skład pożywki musi być tak dobrany, by gwarantował optymalne warunki wzrostu i rozwoju badanych mikroorganizmów. 

W związku z tym, podłoże musi posiadać:

• odpowiedni zestaw związków chemicznych

• optymalny odczyn

• ciśnienie osmotyczne

• musi być jałowe

Istnieje wiele kryteriów podziału pożywek. Najczęściej podstawą podziału jest: 

• skład chemiczny pożywek

• wymagania pokarmowe drobnoustrojów

• cel stosowania

• konsystencja pożywek

Ze względu na charakter chemiczny składników wyróżnia się pożywki:

• naturalne

• syntetyczne

• półsyntetyczne

W zależności od wymagań pokarmowych drobnoustrojów pożywki dzieli się na:

• proste

• złożone

Zależnie od celu, jakiemu mają służyć, pożywki dzieli się na:

• ogólne 

• selektywne (wybiórcze)

Pod względem konsystencji pożywki dzieli się na:

• płynne

• półpłynne 

• stałe

Krótka charakterystyka poszczególnych typów pożywek

• Naturalne - przygotowywane są z produktów pochodzenia naturalnego np. mleka, bulionu, wyciągów roślinnych lub glebowych.

• Syntetyczne - mają ściśle zdefiniowany skład chemiczny zarówno pod względem ilościowym, jak i jakościowym. Stosowane są między innymi w badaniach diagnostycznych.

• Półsyntetyczne - wykonywane są ze składników naturalnych i syntetycznych związków chemicznych.

 

• Proste - stosowane dla prototrofów, czyli drobnoustrojów, którym wystarcza w podłożu prosty związek organiczny, wykorzystywany do budowy wszystkich niezbędnych składników komórki.

• Złożone - służą do hodowli auksotrofów tj. drobnoustrojów, które nie są w stanie syntetyzować niektórych składników komórki np. pewnych aminokwasów czy witamin i związki te należy im dostarczać w pożywce.

 

• Ogólne - na których rosną różne grupy fizjologiczne drobnoustrojów np. bulion mięsny. Jest to podłoże płynne. Przygotowuje się je z wyciągu z mięsa do którego dodaje się 1-2% peptonu i 0,5% NaCl.

• Wybiórcze - w celu wyizolowania jednej grupy fizjologicznej mikroorganizmów, oznaczającej się określonymi wymaganiami pokarmowymi np.

1. Podłoże wg Martina do hodowli grzybów. Wybiórczość podłoża powodowana jast przez róż bengalski, streptomycynę i niskie pH.

2. Podłoże wg Bunta i Roviry z dodatkiem wyciągu glebowego stosowana jest do izolacji i liczenia mikroorganizmów glebowych.

Podłoża:

• płynne - powinny być klarowne, a wszystkie składniki muszą być całkowicie rozpuszczone (do 0,5 % agaru).

• półpłynne - zestalone małą ilością substancji żelującej (0,5-1,5 % agaru).

• stałe - zestalone większą ilością substancji żelującej(1,5-2 % agaru, ok 15% żelatyny). Można w próbówkach po sterylizacji zestalić w postaci tzw. słupka lub przez ułożenie przed zastygnięciem w położeniu pochyłym w postaci tzw. skosu agarowego.

Substancje zestalające - są to substancje, które pozwalają na zestalenie pożywek. Do najczęściej używanych substancji zestalających należy agar i żelatyna.

Agar - jest wysuszoną, hydrofilną, koloidalną substancją wyekstrahowaną z glonów znanych jako agarofity. Składa się on z dwóch polisacharydów - agarozy i agaropektyny w zmiennych proporcjach zależnych od strefy pochodzenia glonów.  Temperatura upłynnienia podłoża z agarem wynosi około 100ºC, a temperatura zestalania około 45ºC. Poniżej tej temperatury podłoże z agarem zastyga tworząc trwałą galaretę. Nie stanowi substancji odżywczej tylko czynnik zestalający podłoże. W handlu dostępny jest w postaci włókien lub proszku.-

Agar odżywczy sporządza się z bulionu z dodatkiem 1,5 - 2% agaru.

Żelatyna - jest substancją białkową. Otrzymuje się ją w wyniku hydrolizy kolagenu czyli białka występującego w tkance łącznej zwierząt. Temperatura upłynnienia podłoża z żelatyną wynosi około 25ºC, a temperatura zestalania około 20ºC. Wykorzystywana jest przez drobnoustroje o właściwościach proteolitycznych.

Żelatynę odżywczą sporządza się z bulionu dodając około 15% żelatyny.

2. Naczynia i urządzenia do hodowli drobnoustrojów: płytki Petriego, probówki bakteriologiczne, kolby, pipety, cieplarki, suszarki.

-Płytki Petriego - są to dwie szklane szalki; górna ma nieco większą średnicę i niższy brzeg niż dolna, wskutek czego szalki zachodzą na siebie i można je swobodnie zamykać i otwierać. Służą do zakładania hodowli, liczenia, badań diagnostycznych i morfologicznych drobnoustrojów. Mają zastosowanie wyłącznie przy użyciu podłoży stałych.

Po zestaleniu pożywek agarowych wydziela się z nich woda kondensacyjna, która może rozmyć kolonie wyrosłe na płytkach Petriego, dlatego należy płytki z pożywkami zestalonymi agarem inkubować zawsze odwrócone dnem do góry. 

Probówki bakteriologiczne - bez kołnierzyka o różnych wymiarach. Stosowane do hodowli i przechowywania drobnoustrojów oraz do wykonywania rozcieńczeń np. gleby, mleka. Mają zastosowanie przy użyciu podłoży płynnych i stałych (słupki i skosy). Zamyka się je korkami z waty, tworzywa sztucznego lub gumowego.

Probówki chemiczne - stosowane do analiz chemicznych i biochemicznych w mikrobiologii. Posiadają kołnierzyk ułatwiający przelewanie. 

W mikrobiologii wykorzystywane są kolby różnego typu i wielkości. Najczęściej są stosowane kolby stożkowe, kuliste lub płaskodenne. Służą do sporządzania pożywek, roztworów oraz do hodowli drobnoustrojów na pożywkach płynnych. Zamyka się je korkami z waty, lub tworzywa gumowego. --Kolby -stożkowa i kulista płaskodenna -

Pipety (kalibrowane i automatyczne) - służą do posiewów hodowli płynnej oraz do przygotowywania rozcieńczeń .

Pipety pasterowskie - do nanoszenia materiału na szkiełka lub do posiewów wgłębnych w probówkach. 

Przed wyjałowieniem część ustnikową pipety zatyka się zacikiem, co zabezpiecza materiał pobierany pipetą przed zakażeniem z zewnątrz a szczególnie przed przedostaniem się drobnoustrojów do ust. -

-Pipety automatyczne

Szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe - służą do przygotowywania preparatów mikroskopowych. Szkiełka Lindnera z wgłębieniem przeznaczone są do obserwacji preparatów przyżyciowych w wiszącej kropli. --Szkiełka mikroskopowe

a). przedmiotowe

b). nakrywkowe

Cieplarki - są to mniejsze lub większe szafy z półkami, zaopatrzone w urządzenia ogrzewające i termostatowe odpowiednio izolowane termicznie. Stałość temperatury zapewnia termostat. Służą do hodowli drobnoustrojów na pożywkach płynnych i stałych. Różne gatunki drobnoustrojów wymagają różnych temperatur do prawidłowego wzrostu i rozwoju.

Suszarka - szafka wyposażona w izolację cieplną oraz grzałki elektryczne i termoregulator, służąca do sterylizacji szkła laboratoryjnego (kolb, probówek, pipet, płytek Petriego) w temp. około 180^OC przez około 3 godziny. Czyste, suche szkło laboratoryjne przygotowuje się do jałowienia owijając je w papier, folię aluminiową lub umieszcza się w specjalnych pojemnikach metalowych (tubusach). W metalowych tubusach muszą być pootwierane otwory aby był zapewniony swobodny obieg powietrza. -

Uwagi na temat jałowienia w suszarkach

• Szkło wstawiamy do zimnej suszarki.

• Po skończeniu sterylizacji nie wyjmujemy szkła od razu.

• Szkło musi być odpowiednio zapakowane.

• Nie sterylizujemy podłoży biologicznych.

3. Podstawowe zabiegi stosowane w mikrobiologii:

a). sterylizacja pożywek (metoda termiczna, filtracja).

Sterylizacja (wyjaławianie) - zabieg prowadzący do zabicia lub usunięcia drobnoustrojów.

Sterylizacja termiczna polega na zastosowaniu odpowiedniej temperatury.

Wyróżniamy sterylizację termiczną:

• na sucho (nie stosuje się do jałowienia podłoży) - wyżarzanie, opalanie i wyjaławianie w suszarkach. 

• na mokro - autoklawowanie, pasteryzacja i tyndalizacja 

Pożywki najczęściej jałowi się na mokro, w gorącej parze wodnej, w aparatach zwanych autoklawami.

Autoklaw - jest to kocioł o podwójnych ścianach i podwójnym dnie, zaopatrzony w manometry, termometr oraz zawór bezpieczeństwa i zawór odpowietrzający. W górnej części znajduje się pokrywa mocowana specjalnymi śrubami. Czynnikiem jałowiącym jest przegrzana para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. Sterylizacja odbywa się przy ciśnieniu (1 atmosfery) w temp. 121^OC - w ciągu 20 - 30 minut. Autoklaw jest najczęściej stosowanym aparatem do jałowienia, oprócz pożywek można w nim jałowić sprzęt, który w suszarce przy znacznie wyższej temperaturze może ulec zniszczeniu.-

Nie wszystkie jednak pożywki można jałowić pod zwiększonym ciśnieniem w autoklawach. Pożywki zwierające cukry, żelatynę, a także roztwory witamin i inne substancje ulegające rozkładowi pod wpływem wysokiej temperatury wyjaławia się w bieżącej parze wodnej w temp. do 100^OC. Proces tn nazywa się pasteryzacją.

Aparat Koch - jest to kocioł metalowy, znacznie lżejszy od autoklawu, o uproszczonej budowie, przykryty luźną pokrywą. Czynnikiem jałowiącym jest bieżąca para wodna o temp. do 100^OC. Czas sterylizacji nie przekracza zwykle 30 minut.

W bieżącej parze wodnej o temp. do 100^OC giną wegetatywne formy drobnoustrojów, natomiast nie zostają zniszczone formy przetrwalne drobnoustrojów odporne na wysoką temperaturę. Dla uzyskania pełnej jałowości materiału stosujemy metodę trzykrotnego ogrzewania w temp.100^OC w ciągu 30 minut co 24 godziny. W między czasie materiał przenosi się do inkubacji w cieplarce w celu umożliwienia wykiełkowania przetrwalników. Zabieg ten nosi nazwę tyndalizacji.

Wyjaławianie przez filtrację - metodę tę stosuje się do podłoży płynnych, które pod wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyczne bądź chemiczne (surowica, roztwory mocznika i niektórych cukrów). Metoda filtracji polega głównie na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze, którego pory są mniejsze od średnicy drobnoustrojów. Istnieje wiele rodzajów takich filtrów, różniących się materiałem z którego są wykonane oraz konstrukcją np.:

• Berkefelda - wykonany z ziemi okrzemkowej.

• Chamberlanda - z nieglazurowanej porcelany.

• Seitsa - azbestowe.

• Schotta - ze spiekanego szkła 

• membranowe (molekularne) - przygotowywane z żelatyny, pergaminu, poliwęglanów, błon zwierzęcych itp.

Filtry są przed użyciem sterylizowane wraz z zestawem naczyń, używanych w procesie sączenia. Proces sączenia odbywa się w ten sposób, że filtr łączy się z naczyniem, z którego usuwa się powietrze za pomocą pompy wodnej. Ciśnienie atmosfery przeciska płyn przez ścianki filtrów, a drobnoustroje większe od porów zostają zatrzymane.

b). Sterylizacja szkła bakteriologicznego (metoda termiczna)

• na sucho - wyjaławianie w suszarkach.

• na mokro - autoklawowanie

c). Dezynfekcja

Metoda chemiczna - polega na stosowaniu związków chemicznych do zabijania drobnoustrojów (dezynfekcja).

Do dezynfekcji stosuje się zasady (węglan sodu), kwasy (kwas siarkowy), środki utleniające (chloramina, chlor), sole metali ciężkich (sublimat - chlorek rtęci), alkohole (etylowy), formalinę, krezol, i amonowe zasady czwartorzędowe itd.

d). Posiew materiału mikrobiologicznego ezą i pipetą (jałowienie ez i igieł)

Posiew - wprowadzenie badanego materiału (np. zawiesiny drobnoustrojów, zawiesiny wodnej gleby, cząsteczek gleby) na podłoże hodowlane lub do pożywki.

Przesiew - przeniesienie drobnoustrojów z podłoża na podłoże.

Pobieranie materiału wykonuje się za pomocą ezy, pipety itp.

Eza - oczko wykonane ze specjalnego rodzaju drutu i osadzone w oprawce metalowej, służy do wykonywania posiewów, przesiewów i sporządzania preparatów mikroskopowych.

Igła - prosty drucik w oprawce metalowej, służy do wykonywania posiewów wgłębnych i sporządzania preparatów mykologicznych (grzybowych).--

W zależności od konsystencji materiału posiewnego i podłoża, które należy zaszczepić, dobiera się odpowiedni sposób przeszczepiania wg. poniższego schematu 

• Z pożywki płynnej - na pożywkę płynną (pipetą, ezą)

• Z pożywki płynnej - na skos (pipetą, ezą)

• Z pożywki płynnej - na płytkę (*metoda powierzchniowa - pipetą, ezą, **metoda wgłębna - pipetą)

• Z pożywki stałej  - na pożywkę płynną (ezą)

• Z pożywki stałej  - na skos (ezą)

• Z pożywki stałej  - na płytkę (ezą)

*Metoda powierzchniowa - niewielką ilość rozcieńczonego materiału nanosi się pipetą na zestaloną pożywkę i rozprowadza szklaną głaszczką po całej powierzchni. 

**Metoda wgłębna - rozcieńczony materiał badany wprowadza się do płytki Petriego, a następnie zalewa płynnym, wystudzonym (ok. 50^oC) podłożem. Całość miesza się ruchami kolistymi i pozostawia do zastygnięcia.

Wyżarzanie - to sterylizacja przez rozgrzanie do czerwoności w płomieniu palnika, a następnie 3 krotne przesunięcie w płomieniu palnika oprawki wyżarzanego narzędzia - ezy lub igły.

Opalanie - polega na krótkotrwałym kontakcie płomienia np. z brzegami naczyń zawierających pożywki, wlotami probówek. Głaszczkę opala się zanurzając w alkoholu i zapalając w płomieniu palnika.

Przeszczepianie etapy

• w przypadku hodowli płynnej dokładnie mieszamy materiał

• wyżarzamy ezę lub opalamy pipetę trzymając ją w jednej ręce

• probówkę z badanym materiałem bierzemy w drugą rękę

• otwieramy probówkę biorąc korek pomiędzy 5 palec ręki trzymającej ezę (pipetę)

• opalamy wlot probówki (probówki  podczas przeszczepiania trzymamy możliwie jak najbardziej przechyloną, co zapobiega zakażeniu hodowli z powietrza) 

• studzimy ezę o wewnętrzną ściankę probówki a następnie pobieramy materiał

• opalamy ponownie wlot probówki, zamykamy korkiem i odstawiamy do statywu

• bierzemy probówkę z pożywką które będziemy szczepili

• otwieramy probówkę biorąc korek pomiędzy 5 palec ręki trzymającej ezę (pipetę)

• opalamy wlot probówki

• wprowadzamy ezę (pipetę) do probówki 

• szczepimy opłukując ezę pożywce (w przypadku skosu rysujemy wężyk na powierzchni podłoża zaczynając od dołu ku górze), natomiast z pipety pozwalamy swobodnie wypłynąć materiałowi (nie wydmuchujemy !)

• opalamy ponownie wlot probówki, zamykamy korkiem i odstawiamy do statywu

• wyżarzamy ezę i odstawiamy do statywu; pipetę odkładamy do pojemnika ze środkiem dezynfekyjącym

Celem posiewu może być:

• Odświeżenie hodowli drobnoustrojów w celu utrzymania ich żywotności i aktywności.

• Izolacja czystych kultur z badanego materiału.

• Diagnostyka wyizolowanych szczepów w celu określenia ich przynależności do gatunku, rodzaju lub określonej grupy drobnoustrojów.

Posiewy diagnostyczne służą do badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych.

Po wykonaniu posiewu, płytki umieszcza się w cieplarkach i inkubuje w optymalnej temperaturze (np. 28^oC) przez określony czas dostosowany do wymagań drobnoustrojów.

Część praktyczna

Ćwiczenie wysiewu ezą i pipetą płynów doświadczalnych (woda z barwnikiem i bez barwnika).

Posiew redukcyjny - demonstracja.

Posiew redukcyjny - zmniejsza liczbę drobnoustrojów wysiewanych na jednostkę powierzchni podłoża zestalonego i ma na celu uzyskanie kolonii z jednej komórki macierzystej (czysta kultura).

Kolonią - nazywamy zespół komórek widoczny gołym okiem powstały z jednej komórki macierzystej. Spośród kolonii rosnących na płytce wybieramy jedną do posiewu redukcyjnego. Pobierany jałowo materiał rozprowadzamy ezą na powierzchni płytki z podłożem agarowym gęstymi zygzakowatymi ruchami, rozcieramy materiał na 1/2 powierzchni płytki, obracamy płytką o 90^o i znów ruchami zygzakowatymi, zahaczając o posianą poprzednio powierzchnię rozcieramy na 1/2 powierzchni płytki, czynność jeszcze raz powtarzamy.

Część praktyczna

Należy obejrzeć płytkę z wykonanym posiewem redukcyjnym bakterii - wykonać i opisać rysunek.

ĆWICZENIE II

Temat: Działanie czynników fizycznych i chemicznych na drobnoustroje.

Do czynników fizycznych mających wpływ na drobnoustroje zaliczyć można:

• temperaturę

• ciśnienie osmotyczne i hydrostatyczne

• potencjał oksydacyjno- redukcyjny

• napięcie powierzchniowe

• pH

• promieniowanie

Natomiast do czynników chemicznych zaliczamy:

• konserwanty 

• barwniki

• środki dezynfekcyjne np. fenole, alkohole, związki chloru itp.

• antybiotyki.

Drobnoustroje wykazują stosunkowo duży zakres tolerancji na zmiany warunków środowiska które mogą powodować zahamowanie wzrostu komórek, uszkodzenia lub prowadzą do śmierci drobnoustroju (działanie bakterio - grzybostatyczne lub bakterio - grzybobójcze).

Określenie wpływu działania czynników fizycznych i chemicznych na procesy życiowe mikroorganizmów pozwala z jednej strony opracować, optymalne metody hodowli, z drugiej zaś określić przydatność różnych związków chemicznych i czynników fizycznych w procesach sterylizacji. 

1. Wpływ temperatury na rozwój bakterii (Bacillus subtilis, Escherichia coli) - założenie doświadczenia.

Obok wody i ciśnienia osmotycznego, temperatura jest jednym z podstawowych czynników środowiska wpływających na rozwój drobnoustrojów.

Mikroorganizmy mogą wykazywać aktywność życiową tylko w pewnych granicach temperatur, różnych dla poszczególnych gatunków. 

Poniżej temperatury minimalnej mikroorganizmy nie rozwijają się, lecz na ogół nie giną. Natomiast powyżej temperatury maksymalnej nie tylko ustaje ich rozwój, ale nawet niekiedy nieznaczne jej przekroczenie może spowodować śmierć mikroorganizmów. Jest to tak zwana temperatura krytyczna, po przekroczeniu której następuje cieplna denaturacja białka drobnoustrojowego. Najodpowiedniejszą dla rozwoju mikroorganizmów jest temperatura optymalna.

Na podstawie punktów kardynalnych wyróżniamy: 

• Zimnolubne - psychrofilne lub kriofilme (bakterie morskie - fotosyntetyzujące i bakterie żelazowe np. Gallionella)

- optymalna temperatura do wzrostu < 20°C

- minimalna ok. temperatury zamarzania

- maksymalna 25 - 30°C

• Mezofilne - liczne patogeny, bardzo powszechne saprofity (E. coli, Salmonella typhi, Brucella bovis, Shigella sp.).

- optymalna temperatura do wzrostu 20 - 40°C

- minim. 10 - 25°C

- maks. 40 - 45°C

• Termofile - ciepłolubne, występują w glebie, rozkładających się resztkach roślinnych, gorących źródłach (B. stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris).

- optymalna temperatura do wzrostu 45 - 60°C

- min. 25 - 45°C

- maks. 70 - 80°C

• Można wyróżnić również termofile ekstremalne  - optimum wzrostu w temperaturze ok. 65- 80 ^oC i hipertermofile rosnące między 80 - 100 ^oC (Pyrodictium occultum - ścisły beztlenowiec redukujący siarkę - może rosnąć przy temperaturze - 105 ^oC )

Temperatura może działać na drobnoustroje:

- bakteriostatycznie (hamuje rozwój komórek).

- bakteriobójczo (zabija komórki).

Część praktyczna

Należy wysiać po jednym oczku ezy zawiesiny bakterii do probówek z bulionem:

a). 2 probówki zaszczepione Escherichia coli 

b). 2 probówki zaszczepione Bacillus subtilis

Po jednej probówce z bulionem zaszczepionym E. coli i B. subtilis należy wstawić do łaźni wodnej o temp. 85^oC na 10 minut. Po tym czasie należy probówki schłodzić w strumieniu zimnej wody. Hodowle spasteryzowane i kontrolne E. coli i B. subtilis należy wstawić do cieplarki na 24 h o temp. odpowiednio: 37^oC i 28^oC. 

2. Wpływ promieniowania UV na bakterie (E. coli) - demonstracja.

Promienie ultrafioletowe mają właściwości bakteriobójcze. Siła zabójczego działania energii promienistej ultrafioletu zależy od długości fali. Najsilniej działają promienie UV o długości fali ok. 250 nanometrów. Uszkadzają one struktury nukleinowe drobnoustrojów.

Część praktyczna

O zabójczym działaniu promieni UV na bakterie można się łatwo przekonać. Na płytkę Petriego wylano agar odżywczy a następnie wysiano szczep E. coli. Płytkę otworzono i poddano promieniom UV, część płytki przykryto.

Należy obejrzeć, narysować i opisać płytkę z hodowlą E. coli na agarze odżywczym po naświetleniu promieniami UV.

3. Wpływ ciśnienia osmotycznego (glukoza i NaCl) na drobnoustroje (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) - demonstracja.

Wprowadzenie do środowiska płynnego, w którym znajdują się drobnoustroje, odpowiednich ilości np. cukru lub soli kuchennej powoduje znaczne podniesienie ciśnienia osmotycznego.

Pomimo obecności wody, drobnoustroje nie są w stanie z niej korzystać, gdyż ciśnienie osmotyczne w komórce jest w tym przypadku niższe od ciśnienia zewnętrznego.

Wytrzymałość na ciśnienie osmotyczne poszczególnych drobnoustrojów jest różna. Są, takie które  giną nawet po nieznacznym podwyższeniu ciśnienia osmotycznego środowiska. Inne, szczególnie odporne pod tym względem, mogą rozwijać się w roztworach wodnych o bardzo dużym stężeniu soli kuchennej lub cukru. Są to tzw. osmofile. Bakterie ciśnieniolubne, które mają duże zapotrzebowanie na NaCl oraz są wytrzymałe na duże stężenia soli kuchennej, nazywa się halofilami. 

Wytrzymałość na ciśnienie osmotyczne niektórych mikroorganizmów często zależy od odczynu środowiska, w którym przebywają. Na przykład niektóre drożdże mogą rozwijać się w środowisku o pH = 2,5 w 14% stężeniach soli. Te same drożdże mogą się rozwijać dobrze w wyższych stężeniach soli kuchennej, nawet przy 20%, jeśli tylko pH środowiska wzrośnie i będzie wynosiło około 7.

4. Wpływ stężenia jonów wodorowych (pH 4, 7, 10) na drobnoustroje (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) - demonstracja.

Wpływ pH środowiska na rozwój drobnoustrojów jest bardzo duży. Do ich prawidłowego rozwoju jest potrzebny odpowiedni odczyn środowiska. Poszczególne rodzaje, a nawet gatunki i szczepy drobnoustrojów mają ściśle określoną wielkość pH, przy którym ich rozwój jest najlepszy. 

Zwykle kwaśniejsze środowisko sprzyja rozwojowi grzybów, tak jak środowisko o odczynie obojętnym lub lekko zasadowym jest bardziej odpowiednie dla rozwoju bakterii i promieniowców. Należy uwzględnić także fakt, że poszczególne drobnoustroje rozwijają się tylko w pewnych granicach wartości pH. U jednych drobnoustrojów zakresy te są bardzo wąskie, u innych szerokie, np. większość bakterii rośnie dobrze w granicach pH 4 - 9. Jednakże pewne bakterie siarkowe rozwijają się jeszcze całkiem dobrze przy bardzo niskim pH poniżej 1. 

Część praktyczna

Należy obejrzeć i opisać hodowle E. coli i Saccharomyces cerevisiae:

1. w bulionie z dodatkiem glukozy w stężeniach: 1, 10 i 50%.

2. w bulionie z dodatkiem NaCl w stężeniach: 1, 3 i 10%.

3. w bulionie o pH: 4, 7 i 10.

Proszę określić intensywność wzrostu na podstawie oceny stopnia zmętnienia hodowli w porównaniu do pożywek niezaszczepionych stosując skalę ocen:

brak wzrostu - (-)

wzrost słaby - (+)

wzrost dobry - (++)

wzrost silny - (+++)

Uzyskane wyniki należy wpisać do tabeli:

Szczep		Glukoza			NaCl			pH
				1 %	10 %	50 %	1 %	3 %	10 %	4	7	10
	Kontrola	1
		2
		3
	E. coli	1
		2
		3
	S. cerevisiae	1
		2
		3

Objaśnienie: kontrola - pożywka nie zaszczepiona

Na podstawie uzyskanych wyników należy określić optymalne warunki do rozwoju badanych szczepów oraz ocenić skuteczność działania ciśnienia osmotycznego i odczynu pożywki na wzrost.

5 a). Wpływ środków dezynfekcyjnych (sublimat) na bakterie (Escherichia coli) - demonstracja.

Działanie środków dezynfekcyjnych można sprawdzić metodą studzienkową. Na płytkę Petriego wylano agar odżywczy i zaszczepiono zawiesiną przygotowaną z hodowli E. coli. W podłożu z hodowlą wycięto korkoborem (zanurzony w denaturacie i opalony) studzienkę, którą napełniono 0,1% roztworem sublimatu (HgCl₂). Płytkę zamknięto i wstawiono do cieplarki gdzie inkubowano ją w temp. 28^oC przez 1 tydzień.

Część praktyczna

Należy obejrzeć, narysować i opisać płytkę z hodowlą E. coli poddaną działaniu roztworu sublimatu (w stężeniu 0,1%).

5 b). Skuteczność działania środków dezynfekcyjnych (alkohol etylowy 75%) i detergentów (mydło) na drobnoustroje - nastawienie doświadczenia.

Część praktyczna

Aby zbadać skuteczność dezynfekcyjnego działania alkoholu etylowego i mydła na mikroflorę skóry i dłoni należy płytkę Petriego z agarem odżywczym podzielić na 3 części. 

W każdej z nich zrobić lekki odcisk palca:

1. brudnego

2. umytego wodą i mydłem 

3. przemytego watą zwilżoną etanolem (75%)

Założone hodowle należy umieścić w cieplarce w temperaturze 28^oC na ok. 48h.

ĆWICZENIE III

Temat I: Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na drobnoustroje c.d.

1. Wpływ temperatury na bakterie - obserwacja hodowli Escherichia coli i Bacillus subtilis założonych na poprzednim ćwiczeniu.

Część praktyczna

Obserwacja hodowli E. coli i B. subtilis założonych na poprzednich ćwiczeniach. Oznaczenie intensywności wzrostu hodowli pasteryzowanych i nie pasteryzowanych badanych szczepów na podstawie oceny stopnia zmętnienia hodowli w porównaniu do kontrolnej pożywki jałowej. Ocenę intensywności wzrostu hodowli wpisać do poniższej tabeli..

 wzrost „+”                brak wzrostu „-”

	Intensywność wzrostu
		Pasteryzowane		Nie pasteryzowane
	E. coli
	B. subtilis

2. Skuteczność działania środków dezynfekcyjnych i detergentów - odczytanie doświadczenia założonego na poprzednim ćwiczeniu.

Część praktyczna

Porównanie wzrostu kolonii wyrosłych na płytkach Petriego po wykonaniu odcisków palca. Zwrócić uwagę na liczbę kolonii i ich różnorodność (barwę, wielkość, wypukłość powierzchni, linia brzegów). Na podstawie obserwacji makroskopowej określić skuteczność działania mydła i alkoholu. Narysować i opisać płytkę z odciskami palców, zanotować wnioski.

Ocena morfologii kolonii - cechy kolonii.

Przy ocenie morfologii kolonii bierze się pod uwagę następujące cechy:

1. Wzrost kolonii:

• powierzchniowy,

• podpowierzchniowy,

• wgłębny,

2. Wielkość kolonii:

• mała - o średnicy do 1 mm,

• średnia - o średnicy 1-3 mm,

• duża - o średnicy powyżej 3 mm.

3. Kształt kolonii:

a). punktowa, b). okrągła, c). rizoidalna, d). nieregularna, e). strzępiasta.

 4. Profil kolonii:

a). płaski, b). lekko wypukły, c). silnie wypukły, d). stożkowaty, e). wypukły z powierzchnią brodawkowatą, f). wrastający w podłoże, g). kraterowaty.

 

5. Brzeg kolonii:

a). regularny, b). falisty, c), d), e), j). nieregularny, f), g), h), i). rozlany, strzępiasty

6. Przejrzystość kolonii:

• przejrzysta,

• nieprzejrzysta,

• półprzejrzysta

7. Fluorescencja kolonii - obecna lub brak.

8. Barwa kolonii - obejmuje obecność pigmentu lub jego brak (kolonia bezbarwna), intensywność zabarwienia, zabarwienie otoczenia kolonii związane z dyfuzją barwnika do podłoża;

9. Struktura kolonii

• ziarnista (przy dotknięciu wyczuwalna ziarnistość),

• krucha, pylista (przy dotknięciu rozpada się),

• włóknista (przy podnoszeniu widoczne włókna),

• skórzasta (zwarta i trudna do rozmazania)

• mazisto-kremowa (ciągnąca się)
   

• 10. Zapach kolonii - obecny lub kolonia bez zapachu, określa się intensywność zapachu i czy jest charakterystyczny

Temat II: Wybrane metody stosowane do prowadzenia hodowli drobnoustrojów.

Tlen stanowi jeden z czynników selekcjonujących zespoły drobnoustrojów i aktywujących, bądź też hamujących rozwój określonych ich grup. Ma on oczywiście wpływ na przebieg procesów biochemicznych, prowadzonych przez fizjologicznie różne grupy drobnoustrojów w środowiskach naturalnych lub sztucznie wytworzonych.

Biorąc pod uwagę wpływ tlenu na drobnoustroje, można je podzielić na kilka grup (wg. Gołębiowskiej).

Bezwzględne tlenowce — drobnoustroje, dla których tlen jest czynnikiem niezbędnym nie tylko dla wzrostu i rozwoju, lecz także dla utrzymania się przy życiu. Do takich drobnoustrojów należą np. autotroficzne bakterie utleniające amoniak do azotanów. Do bezwzględnych tlenowców zalicza się jednak i takie organizmy, które wprawdzie nie mogą rosnąć i rozwijać się bez udziału tlenu, ale zachowując żywotność mogą przetrwać pewien okres w środowisku o niskiej zawartości tlenu. Do takich organizmów należy większość drobnoustrojów glebowych.

Mikroaerofile — czyli względne tlenowce, stanowią grupę pokrewną tlenowcom bezwzględnym. Są one bardzo rozpowszechnione w przyrodzie, a zwłaszcza w glebie. Rosną i rozwijają się najlepiej wtedy, gdy stężenie tlenu w środowisku jest niskie.

Względne beztlenowce — drobnoustroje, które mogą żyć w obecności lub przy braku tlenu wykorzystując do procesów utleniania tlen wolny lub inny substrat energetyczny. Do tej grupy zalicza się takie organizmy jak drożdże, które mogą oddychać zarówno tlenowo, jak i w warunkach beztlenowych fermentując wtedy cukry. Względnymi beztlenowcami są też niektóre gatunki bakterii fotosyntetyzujących.

Bezwzględne beztlenowce — drobnoustroje, których wzrost jest hamowany nawet przez małe ilości tlenu, prawdopodobnie ze względu na nieodwracalne utlenienie przenośników elektronów i wytwarzanie się toksycznych nadtlenków np. H₂O₂. Do tej grupy należą niektóre gatunki Clostridium.

Jest oczywiste, że tak jak przy innych podziałach drobnoustrojów na grupy fizjologiczne i w tym przypadku trudno wyraźnie je rozgraniczyć. Tlenowce bezwzględne i względne, mikroaerofile i beztlenowce mogą bytować i rozwijać się w dość różnych warunkach w zależności nie tylko od stopnia natlenienia, środowiska, lecz także od innych czynników ekologicznych.

1. Hodowle prowadzone w warunkach tlenowych - pokaz płynnych hodowli stacjonarnych i wytrząsanych Penicillium sp. lub Aspergillius sp.

Bardzo liczna grupa drobnoustrojów wymaga do wzrostu i rozwoju dostępu tlenu (lub powietrza). Hodowle takich drobnoustrojów prowadzi się na wytrząsarkach w celu napowietrzania hodowli.

Wytrząsarka - wyróżnia się dwa typy: o ruchu posuwisto-zwrotnym z regulowaną amplitudą drgań (na zdjęciu obok) rotacyjne, z regulowanym skokiem drgań

Aerator - jest to aparat do hodowli tlenowców. Działanie jego polega na doprowadzeniu tlenu z zewnątrz przez zestaw filtrów bakteriologicznych zapobiegających zakażeniu hodowli. 

Metody hodowli drobnoustrojów tlenowych dzieli się na: 

• powierzchniowe: na podłożach płynnych (np. hodowla na brzeczce, bulionie) i podłożach stałych (np. hodowla drobnoustrojów na skosie i na płytce Petriego).

• wgłębne - tylko na podłożach płynnych.

2. Metody stosowane do prowadzenia hodowli drobnoustrojów w warunkach beztlenowych.

Drobnoustroje beztlenowe, dla których obecność tlenu jest szkodliwa należy hodować w środowisku pozbawionym powietrza.

Warunki beztlenowe możemy uzyskać następującymi metodami:

• fizycznymi

• biologicznymi

• chemicznymi 

• mieszanymi

Metody fizyczne

Bakterie beztlenowe można hodować w urządzeniach zwanych anaerostatami, gdzie powietrze zastępuje się gazem obojętnym, np. dwutlenkiem węgla lub azotem. Inną metodą jest hodowla na podłożu Wilsona-Blaira, gdzie na zestalone podłoże Wilsona-Blaira, z zaszczepionym uprzednio materiałem, wylewa się cienką warstwę agaru wodnego, odcinającego dostęp tlenu. W metodach probówkowych jako warstwę odcinającą dostęp tlenu można zastosować również płynną, jałową parafinę, po uprzednim usunięciu tlenu z pożywki przez 15-20-minutowe gotowanie jej na łaźni wodnej.

Anaerostaty - są to urządzenia w których powietrze zastępuje się mieszaniną różnych gazów lub wytwarza się w nich próżnię. Zamiast gazu w anaerostatach można również stosować mieszaninę pochłaniającą tlen złożoną z ziemi okrzemkowej, węglanu potasowego.

Metody chemiczne

Najczęściej są stosowane w hodowlach probówkowych z użyciem związków chemicznych pochłaniających tlen: pyrogallolu, węglanu potasu, ziemi okrzemkowej. Po wykonaniu wysiewu drobnoustrojów na skosie, część korka z waty wystającą nad brzeg probówki należy odciąć, wcisnąć na ok. l cm w głąb probówki i nasączyć 0,5 cm³ 20% kwasu pyrogallolowego i 0,5 cm³ nasyconego roztworu węglanu sodu lub wapnia. Następnie probówkę natychmiast zamknąć korkiem gumowym, by odciąć dopływ powietrza z zewnątrz. Pyrogallol w warunkach alkalicznych pochłania tlen zawarty w probówce, stwarzając w ten sposób warunki beztlenowe.

Metody biologiczne 

Wymienić tu można metodę płytek Fortnera, polegającą na zaszczepieniu pożywki w płytce (obok siebie) szczepami bakterii tlenowych i beztlenowych, np. rodzajów Pseudomonas i Clostridium. Po posiewie brzegi płytki uszczelnia się plasteliną, odcinając dostęp tlenu do wnętrza płytki. Drobnoustroje tlenowe, wykorzystując do swojego rozwoju tlen, stwarzają sprzyjające warunki do rozwoju bakterii beztlenowych.

Metody mieszane

Są połączeniem wymienionych wcześniej metod. Wśród nich można wyróżnić hodowlę na pożywce wg. Wrzoska, w której tlen zawarty w podłożu jest absorbowany przez kawałki wątroby, a od tlenu pożywka jest oddzielona warstwą płynnej, jałowej parafiny.

Część praktyczna

a). Hodowle w probówkach w wysokim słupie pożywki zalanej warstwą parafiny - demonstracja.

Jest to metoda fizyczna hodowli drobnoustrojów beztlenowych. Warunki beztlenowe uzyskuje się zakładając hodowle w probówkach przy wysokim słupie pożywki  i odcina się dodatkowo dostęp tlenu przez wprowadzenie na pożywkę płynnej warstwy jałowej parafiny.

b). Hodowle płynne z tkankami roślinnymi zastosowanymi jako absorbenty tlenu - demonstracja.

Dodatek tkanek roślinnych w podłożu powoduje absorpcje tlenu z podłoża. Można dodawać również do podłoży tkanki zwierzęce. Przykładem podłoża z tkankami zwierzęcymi jest podłoże wg. Wrzoska. 

c). Płytki Fortnera - demonstracja.

Jest to metoda biologiczna hodowli drobnoustrojów beztlenowych. Polegająca na zaszczepieniu (na jednej płytce) szczepu drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych. Pożywkę na płytce dzieli się na połowę, wysiewając na jedną część szczep beztlenowy, a na drugą szczep tlenowy. Po posiewie brzegi płytki zalepia się plasteliną odcinając dopływ tlenu. Drobnoustroje tlenowe rozwijając się zużywają tlen zawarty wewnątrz płytki i stwarzają tym samym korzystne warunki dla rozwoju beztlenowców.

d). Zastosowanie anaerostatów do prowadzenia hodowli w warunkach beztlenowych - demonstracja.

e). Zastosowanie metody „roll tube” do otrzymywania czystych szczepów drobnoustrojów beztlenowych - demonstracja.

Metoda ta służy do otrzymywania czystych szczepów drobnoustrojów beztlenowych. Do jałowych probówek wlewamy niewielką ilość jałowego podłoża (ok. 2-3 ml.) następnie zaszczepiamy drobnoustrojami. Probówkę wprowadzamy w ruch obrotowy aż podłożę zestali się na ściankach. Do wnętrza probówki wprowadzamy gaz obojętny np. azot zastępując nim powietrze. 

ĆWICZENIE IV

Temat I: Budowa i obsługa mikroskopu.

Mikroskop umożliwia obserwację obiektów niewidocznych gołym okiem. Zwiększając kąt widzenia, pod którym obserwuje się badany obiekt, pomaga w wytworzeniu na siatkówce oka większego obrazu oglądanego przedmiotu. Powiększenia uzyskiwane przez mikroskopy wynoszą od kilkudziesięciu do kilkuset tysięcy razy. 

W zależności od sposobu uzyskiwania powiększenia wyróżniamy mikroskopy:

• świetlne (optyczne)

• elektronowe.

W mikroskopach świetlnych powiększenie uzyskuje się dzięki układowi soczewek optycznych, w mikroskopie elektronowym uzyskuje się powiększony obraz, stosując zamiast fal świetlnych wiązkę elektronów odchylanych elektromagnesami. 

Budowa mikroskopu optycznego z jasnym polem widzenia

1 - okular, 2 - tubus, 3 - oś optyczna, 4 - statyw, 5 - tarcza obrotowa (rewolwer), 6 - obiektywy, 7 - stolik, 8 - kondensor, 9 - oprawka aparatu Abbego, 10 - przesłona, 11 - matówka, 12 - źródło światła, 13 - podstawa, 14 - pokrętło pionowego przesuwu aparatu Abbego, 15 - śruba makrometryczna, 16 - śruba mikrometryczna.  

Części mechaniczne - opis ważniejszych elementów

• podstawa - zapewnia stabilność przyrządu i jest wyposażona w źródło światła 

• statyw - łączy wszystkie części mikroskopu, utrzymuje w stałej odległości układ optyczny obiektywów od okularów

• tubus - metalowa rurka przystosowana w górnej części do zakładania okularu, w dolnej zaś zakończona tarczą obrotową zwaną rewolwerem w której znajdują się obiektywy

• stolik mikroskopowy na którym umieszcza się oglądany preparat, wyposażony jest w urządzenie do przesuwania preparatu za pomocą pokręteł znajdujących się pod stolikiem

• śruba makrometryczna umożliwia znalezienie obrazu

• śruba mikrometryczna służy do ustawienia właściwej ostrości obrazów

Części optyczne - opis ważniejszych elementów

• aparat oświetlający zwany aparatem Abbego znajduje się pod stolikiem i kieruje promienie światła od źródła światła do obiektywu. W skład aparatu wchodzi kondensor - zespół 2-3 soczewek silnie skupiających światło na preparacie, a w konsekwencji na soczewce czołowej obiektywu oraz przesłona irysowa (diafragma) regulująca ilość światła wpadającego do kondensora.

• obiektywy - zbudowane z kilku soczewek i umieszczone na tarczy obrotowej zapewniające prawidłowe włączenie obiektywu w oś optyczną. Najczęściej stosowane obiektywy powiększają 5, 10, 40, 100 razy. Obiektywy dzielimy na suche i immersyjne.

• okulary - zbudowane z zespołu soczewek płasko-wypukłych powiększają na zasadzie lupy. Okulary umieszczone są w nasadce dwuocznej zwanej binokularem.

Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia obiektywu i okularu. W przypadku nasadki dwuokularowej wynik mnoży się jeszcze przez powiększenie nasadki.

 

Temat II. Morfologia grzybów

Obserwacje mikroskopowe preparatów w kropli płaskiej z hodowli wybranych klas grzybów.

Grzyby (Mycota) w przeciwieństwie do bakterii właściwych i promieniowców należą do organizmów eukariotycznych. Nie wykazują zróżnicowania na korzeń, łodygę i liście, a zatem zaliczamy je do plechowców. Plecha grzybów zbudowana jest ze strzępek (hyphae), które tworzą grzybnię (mycelium). Grzybnia może być podłożowa (substratowa lub wgłębna) i powierzchniowa (powietrzna). Grzybnia powierzchniowa często wytwarza chwytniki które służą do pobierania pokarmu jak i przytwierdzania się do podłoża. Grzybnia niektórych pasożytów roślin może wytwarzać strzępki - ssawki które wnikają do wnętrza komórek żywiciela.   Znane są także grzyby nie tworzące grzybni, np. drożdże właściwe; wówczas plecha złożona jest bądź z pojedynczych komórek, bądź pączkując tworzy sznury pseudogrzybni (pseudomycelium). Średnica strzępek waha się w granicach 2-10 ľm. Strzępki bywają wielojądrowe bez przegród poprzecznych - komórczakowe (cenocetyczne) lub częściej wielokomórkowe z poprzecznymi przegrodami (saptae). Septy mają centralny por zapewniający przepływ cytoplazmy pomiędzy komórkami. Wytworami grzybni są różne elementy morfologiczne - formy przetrwalne: skleroty, ryzomorfy, wielopostaciowe owocniki; niekiedy tworzona jest tzw. pseudotkanka, złożona ze zbitej masy grzybni. 

A- strzępka jednokomórkowa (Zygomykotina)

B- strzępka komórczakowa (Ascomycotina)

Komórki grzybów otoczone są ścianą komórkową, u większości zbudowaną przeważnie z chityny z domieszką glukanu, celulozy bądź innych polimerów. Do ściany komórkowej od wewnątrz przylega plazmolemma - półprzepuszczalna lipoproteidowa błona cytoplazmatyczna otaczająca protoplast. Ma ona czynny udział w procesach transportu do i na zewnątrz komórki. Cytoplazma jest roztworem koloidalnym, mającym zdolność ciągłego ruchu. W cytoplaźmie zawieszone są organella komórkowe - jądro komórkowe, rybosomy, mitochondria, wakuole. W komórkach występują sybstancje zapasowe w postaci kropelek tłuszczu, ziaren glikogenu i wolutyny.   

W glebie grzyby występują w postaci grzybni, zarodników, przetrwalników, przy czym grzybnia szybko ulega lizie, zwłaszcza u gatunków nie wykazujących obecności brunatnego, melaninowego pigmentu. Brak chlorofilu i niezdolność do fotosyntezy determinują sposób odżywiania grzybów i rzutują na powiązania z innymi organizmami. Można zatem wyróżnić trzy podstawowe formy ich bytowania - symbiozę, pasożytnictwo i saprofityzm. Partnerami w symbiozie najczęściej bywają rośliny zielone, lecz zdarzają się także owady.

Patogeniczność grzybów jest nagminnie spotykana i odnosi się tak do roślin, jak zwierząt i ludzi. Na podkreślenie zasługuje fakt, że symbioza i pasożytnictwo często występują w obrębie tego samego związku, granica między nimi nie jest stała.

Grzyby, które wykorzystują związki organiczne ze szczątków roślinnych i zwierzęcych, należą do, saprofitów (roztoczy). Stanowią one najliczniejsza grupę.

Zdolność do zasiedlenia określonego podłoża wynika z możliwości syntezy enzymów rozkładających zawarte w nim związki. Organizmy o znacznej aktywności enzymatycznej charakteryzują się szerszym zasięgiem występowania. Czynnikami limitującymi pojawienie się różnych gatunków są także tempo wzrostu i zdolność do reprodukcji, właściwości antybiotyczne oraz czynniki fizyczne takie, jak: temperatura, odczyn, ciśnienie osmotyczne i wilgotność środowiska.

Zasadniczymi siedliskami, w których bytują grzyby, są gleba, woda, powierzchnia roślin. Zgodnie z klasyfikacją Garreta wyróżnia się następujące grupy ekologiczne grzybów:

1. grzyby związane z korzeniami: 

1. mikoryzowe,

2. wyspecjalizowane pasożyty;

2. grzyby bytujące w glebie:

1. nie wyspecjalizowane pasożyty, 

2. saprofity:

1. grzyby cukrowe wykorzystujące jako źródło węgla cukry proste,

2. rozkładające ligninę,

3. koprofilne - rozwijające się na nawozie,

4. gatunki pasożytujące na organizmach zwierzęcych, szczególnie amebach i nicieniach.

 I. Klasa Zygomycetes - sprzężniaki. 

Obejmuje grzyby wyłącznie lądowe. Charakterystyczna jest dla nich grzybnia wielojądrowa. Przegrody poprzeczne formują się głównie dla oddzielenia organów rozmnażania. Rozmnażanie bezpłciowe odbywa się przy udziale zarodników sporangialnych, endogenicznych, wytwarzanych w zarodni (sporangium).

W wyniku rozmnażania płciowego z zygoty formują się tzw. zygospory, kiełkujące po okresie spoczynku w strzępkę. Z racji swych grubych błon zarodniki te pełnią funkcję przetrwalników. Są diploidalne.

Rhizopus stolony zarodnia kolummela zarodniki

Mucor strzępek grzybni zarodnia kolummela zarodniki

Część praktyczna

Rhizopus sp. - (pow. 125 i 500x) preparat w kropli płaskiej. 

Mucor sp. - (pow. 125 i 500x) preparat w kropli płaskiej. 

Obserwacja strzępek, ryzoidów i zarodni z zarodnikami. Rysunki grzybni, zarodni, zarodników.

II. Klasa Ascomycetes - workowce właściwe (łącznie z Basidiomycetes tworzą grupę grzybów właściwych czyli wyższych). Do klasy tej, najliczniejszej pod względem liczby gatunków, należą głównie grzyby lądowe, o wielokomórkowej grzybni, której ściany zbudowane są z chityny i glukanu, a wyjątkowo z celulozy. Jedynie u drożdży najczęściej brak typowo wykształconych strzępek. Poszczególne odcinki grzybni są na ogół jedno- lub dwujądrowe. Charakterystyczny dla tej grupy jest sposób rozmnażania płciowego. W jego wyniku, powstają w różnie uformowanych owocnikach worki (ascus), zawierające najczęściej 8 lub wielokrotność tej liczby zarodników workowych (ascospora). U niektórych gatunków drożdży właściwych liczba zarodników w worku jest niższa (1-4) i nie jest stała. Rozmnażanie bezpłciowe odbywa się najczęściej przy udziale zarodników konidialnych, charakteryzujących się znacznym zróżnicowaniem morfologicznym. Chlamydospory to inna forma wegetatywnych spor, które są zwykle grubo obłonione, stąd ich rola w przetrwaniu warunków niekorzystnych dla gatunku. Wśród przedstawicieli tej klasy spotyka się zarówno organizmy saprofityczne, jak i patogeniczne dla roślin, zwierząt i ludzi.

Rodzaj Saccharomyces charakteryzuje się rozmnażaniem wegetatywnym przez pączkowanie oraz wytwarzaniem okrągłych lub owalnych zarodników umieszczonych w workach. Niektóre gatunki, np.  Saccharomyces cerevisiae czy Saccharomyces carlsbergensis zaliczane są do drożdży szlachetnych, charakteryzują się bowiem silnymi właściwościami fermentacyjnymi. w warunkach beztlenowych rozkładają dość duże ilości cukru na alkohol, który nie jest przez nie zużywany. 

Drożdże z rodzaju Saccharomyces dają na pożywkach płynnych osad opadający na dno, a na podłożach stałych tworzą białe lub kremowe kolonie. 

a). Saccharomyces cerevisiae 

Saccharomyces cerevisiae (drożdże piekarskie) mają komórki owalne lub kuliste, występujące na podłożach płynnych pojedynczo lub podwójnie. Fermentują i asymilują większość cukrów. Mogą wykorzystywać etanol jako jedyne źródło węgla. Drożdże należące do tego gatunku używane są w przemyśle fermentacyjnym, a także do produkcji drożdży paszowych i spożywczych.

Saccharomyces cerevisiae

U gatunku Saccharomyces cerevisiae worki stanowią komórki nie różniące się od komórek wegetatywnych i zawierające od 1 do 4 (najczęściej 2) askospor. 

Rozmnażanie się drożdży:

(wg Palucha)

I. Wegetatywnie: a) pojedyncza komórka b, c) pączkowanie d) worek z 4 zarodnikami e, f, g, h) podział jądra w czasie pączkowania

II. Płciowo  i, k, l) zlewanie się komórek (kopulacja) m) powstawanie zygoty n, o) powstawanie worka z 8 zarodnikami

Część praktyczna

• Obserwacja komórek pączkujących Saccharomyces cerevisiae w preparatach przygotowanych z hodowli na podłożu wg Martina. Studenci przygotowują preparat w kropli płaskiej z dodatkiem błękitu metylenowego oraz liczą w trzech polach widzenia komórki zabarwione - martwe i bez zabarwienia - żywe (powiększenie 500x).Rysunek komórki pączkującej.

• Obserwacja worków z zarodnikami Saccharomyces cerevisiae w preparatach w kropli płaskiej  przygotowanych z hodowli na podłożu wg Mc Clary (powiększenie 500x). Rysunek worka z zarodnikami

b). Cheatonium sp. należy do Pyrenomycetates grzybów wytwarzających perytecja. Perytecjum ma własną ścianę. Maczugowate worki zawierają po 8 elipsoidalnych askospor, które wyrastają w dolnej części butelkowatego (gruszkowatego) owocnika i są przemieszane z wstawkami płonnymi. Owocniki otwierają się szczytowym kanałem przez który wyrzucane są zarodniki.

Pokroje ogólne i budowa (w przekroju) owocników typowych dla Plectomycetes (kleistotecjum), Pyrenomycetes (perytecjum) i Discomycetes (apotecjum)

(wg Schlegela)

Część praktyczna

• obserwacja otoczni (perytecjum) Cheatonium sp., pow 125 lub 500x. 

• rysunek z opisem perytecjum. 

• rysunek z opisem worka zarodnikowego z zarodnikami.

III. Klasa Deuteromycetes (Fungi imperfecti) - grzyby niedoskonałe. 

W tej klasie zgrupowano wszystkie grzyby, które nie mają stadiów płciowych, oraz te, u których stadia takie nie zostały jeszcze stwierdzone. Stadia konidialne tych grzybów są bardzo podobne do dobrze znanych Ascomycetes. Do grupy tej włączano pierwotnie grzyby o strzępkach, wielokomórkowych, u których nie stwierdzono rozmnażania płciowego, a jedynie reprodukcję za pomocą bardzo różnie wykształconych konidiów. W miarę rozwoju badań mikologicznych u wielu spośród tych grzybów wykryto stadia płciowe. Organizmy takie przeklasyfikowano wówczas do odpowiedniej klasy naturalnej. Nie mniej ze względów praktycznych utrzymano nadal klasyfikację w obrębie grzybów niedoskonałych. Ogólnie biorąc, do klasy tej zalicza się stadia konidialne znacznej części workowców i niektórych podstawczaków.

Deuteromycetes (Fungi imperfecti) reprezentowane są na ćwiczeniach przez dwa rodzaje -  Fusarium sp i Oidium lactis.

Rodzaj Fusarium, którego znajomość jest ważna z punktu widzenia ochrony roślin (patogen wielu roślin uprawnych), odznacza się bardzo typowymi wielokomórkowymi, sierpowatymi konidiami.

Grzyby z rodzaju Oidium wytwarzają grzybnię wielokomórkową, rozpadającą się na jednokomórkowe fragmenty, zwane, oidiami.

Fusarium sp. a. konidiofor b. konidia c). chlamydospory	Oidium lactis  fragment strzępki grzybni oidia

  

Część praktyczna

• Fusarium sp. - obserwacja preparatu w kropli płaskiej powiększenie 500x. Narysować i opisać rysunek strzępek i konidiów, .

• Oidium lactis - obserwacja preparatu w kropli płaskiej powiększenie 500x. Narysować i opisać rysunek strzępek i oidiów.

---