00

Innym parametrem charakteryzującym proces denaturacji cieplnej jest szerokość temperaturowego przedziału (AT) przejścia ze stanu natywnego w stan zdenaturowany, która wyraża kooperalyw-ność przejścia, tj, stopień jednoczcsności naruszenia wszystkich ogniw heliksowej struktury przy podwyższaniu temperatury. Różne pary zasad azotowych, a więc A T (lub A • U w przypadku RNA) i GC, mają różne energie wiązania, dlatego też wartość temperatury topnienia zależy od składu mikleo-tydowego i wzrasta liniowo wraz ze wzrostem wartości stosunku G + C./(G + C +A+T). Określono liczbową zależność między wartością T_m (wyznaczoną w 0,1 roztworze SSC) a składem nukleotydowym; mol% G C = (T_m — 69,3) • 2,44.

Po ochłodzeniu ogrzanych roztworów DNA wartość efektu hiperchromowego jest w pewnym stopniu odtwarzalna. Powolne ochładzanie roztworu DNA, ogrzanego do temperatury niższej od temperatury topnienia, prowadzi do prawie całkowitego odtworzenia tego efektu. Efekt hiperchromowy nie jest całkowicie odtwarzalny po ochłodzeniu roztworu DNA, ogrzanego do temperatury wyższej niż temperatura topnienia. Odtworzenie komplementarnej struktury podwójnego heliksu kwasu nukleinowego po usunięciu działania czynnika denaturującego (np. po oziębieniu roztworu DNA) nazywa się renaturacją. Prawne całkowita odtwarzalność efektu hiperchromowego nie oznacza, że zaszła rzeczywista renaturacja. Szybkie ochłodzenie ogrzanych roztworów DNA doprowadza do niespecyficznego łączenia się zasad, natomiast pozostawienie próbki w temperaturach nieco niższych od temperatury początku topnienia sprzyja rzeczywistej renaturacji.

Ćwiczenie 10.22. Wyznaczanie pH-metrycznych krzywych topnienia preparatów

DNA (Z. Walter i wsp. 1975: Zesz. Nauk. Uf., Ser. II, s. 15-22)

Zasada: Znany jest fakt, że zmiana środowiska roztworu DNA z obojętnego na zasadowe (pH 11,0-12,0) lub na kwasowe (pH 2,5-3,5) powoduje całkowitą denatu-rację. Miareczkując roztwory DNA roztworami kwasów nieorganicznych stwierdzono wzrost absorbancji DNA w paśmie 249 nm, przy pH 3,5 na skutek protonacji eytozyny. Zmiana wartości gęstości optycznej w zakresie pH 3,5 2,5 świadczy o całkowitej denaturacji preparatu. Przed denaturacją kwasową — dającą rozejście się nici polinukleotydowych w strukturze II-rzędowej cząsteczek poii (GC), a także regionów DNA bogatych w te pary -- zachodzą specyficzne zmiany: protonacja eytozyny w pozycji N_x i formowanie nowego wiązania wodorowego, co z kolei powodowałoby „ślizganie się” par G • C, a w konsekwencji prowadziłoby do pewnej nowej konformacji omawianych związków.

Kontrola spektrofotometryczna miareczkowania roztworów DNA roztworami rozcieńczonych zasad wykazała, że przed procesem denaturacji następuje deprotonacja guaniny. Dla DNA o dużej zawartości par G C (72%) przy pH 11,7 stwierdzono około 15-procentową deprotonację guaniny. Przy jeszcze wyższych wartościach pH dochodzi do odpychania się par zasad, co prowadzi do fazowego przejścia he-liks/kłębek, a więc zmian denaturacyjnych łatwo obserwowalnych spektrofotomet-rycznie (pH-metryczne krzywe topnienia).

Obserwowane spektrofotometrycznie rozejście się nici polinukleotydowych następuje przy skrajnych wartościach pH, tj, poniżej 3,5 i ok. 12,0.

Dużo wcześniej jednak dochodzi do zmniejszenia stabilności DNA, na skutek rozerwania pewnej części wiązań wodorowych, czy oderwania cząsteczek H₂0

400