03

procesowi rugowania z kolumny w trakcie elucji. W ten sposób dochodzi do fizycznego rozdzielenia cząsteczek obu związków. Silne oddziaływanie cząsteczek fenolu z hydrofobowym nośnikiem chromatograficznym powoduje, iż proces eluowania tego związku z kolumny trwałby bardzo długo w przypadku przemywania kolumny tak polarnym rozpuszczalnikiem, jakim jest woda. W celu przyspieszenia tego procesu wzbogaca się clucnt w bardziej hydrofobowy rozpuszczalnik, np. w metanol lub acetonitryl. Im hardziej nicpolarna faza ruchoma, tym łatwiej będzie do niej przechodził fenol z hydrofobowej fazy stacjonarnej i tym szybciej zostanie wyeluowany z kolumny.

W przypadku chromatografii mieszaniny związków o bardzo różnej polarności, nanosi się ich roztwór na kolumnę, kiedy jest ona zrównoważona eluentem o dużej polarności (najczęściej buforem bez metanolu lub zawierającym jego nieznaczną ilość), a następnie zwiększa się stopniowo stężenie metanolu w eluencie tak, aby kolumnę opuszczały coraz bardziej hydrofobowe związki chromatografowanej mieszaniny. Taki sposób prowadzenia elucji nosi nazwę: elucja gradientowa. Jego zastosowanie powoduje jednak, że przed naniesieniem kolejnej próbki na kolumnę niezbędne jest jej zrównoważenie buforem startowym o małym stężeniu metanolu, co przedłuża znacznie czas analiz. Podczas opracowywania metody rozdziału danej mieszaniny związków dąży się więc do dobrania takiego składu eluentu (głównie chodzi o stężenie rozpuszczalnika organicznego w eluencie), aby wszystkie związki analizowanej mieszaniny uległy rozdziałowi i wyrugowaniu z kolumny bez potrzeby zmiany składu eluentu. Taki rodzaj elucji zwany jest elucją izokratyczną. W ćwiczeniu 10.32, zestaw wysokosprawnej chromatografii cieczowej użyty zostanie do rozdziału i ilościowej analizy nukleozydów w trybie chromatografii z odwróconymi fazami, z zastosowaniem elucji izokratyczncj.

Ćwiczenie 10.32. Ocena stopnia metylacji DNA poprzez oznaczanie techniką HPLC 5-metylo-2'-deoksycytydyny i 2'-deoksycytydyny w enzymatycznych hydrolizatach

DNA (K. Białkowski, R. Oliński, własna kompilacja kilku metod)

Zasada: Jednym z głównych mechanizmów regulacji ekspresji genów w wielu komórkach eukariotycznych jest modyfikacja kowalencyjna reszt cytozyny w DNA za pomocą grup metylowych, która prowadzi do powstania 5-metylocytozynv. Metylacji tej dokonują enzymy zwane metylotransferazami DNA, które przenoszą grupę —CH₃ z S-adcnozylometioniny na reszty cytozyny sąsiadujące z guaniną. Metylacja cytozyn w obrębie regulatorowych fragmentów genów prowadzi do wyłączenia aktywności transkrypcyjnej tych genów. Warunkuje to proces powstawania wyspecjalizowanych komórek organizmu, w których dochodzi do ekspresji jedynie części genów całego genomu. Mechanizm represji transkrypcji przez 5--metylocytozynę nie jest dokładnie poznany. Chromatyna zawierająca zmetylowane fragmenty DNA jest silnie skondensowana, co uniemożliwia dostęp do matrycy DNA kompleksowi białek biorących udział w procesie transkrypcji. Prawdopodobnie w proces ten zaangażowane są specyficzne białka wiążące się z resztami 5-metylocytozyny, zwane MeCPl i MeCP2 (MeC — metylocytozyna, P — protein). Stosunek ilości 5-metylocytozyny do ilości niezmetylowanej cytozyny w DNA komórki, wyrażony w procentach, pozwala więc na oszacowanie stopnia jej zróżnicowania. Celem tego ćwiczenia jest oznaczenie tego stosunku w DNA wątroby

423