03

Materiał: Roztwór DNA.

Odczynnik: Bufor TE o pH 8,0: 10 mM Tris/HCl - 1 inM EDTA zawierający bromek ctydyny o stężeniu 2 tygrml.

Aparatura: Transiluminator lub lampa emitujące światło UV.

Wykonanie:

1.    Rozciągnąć fragment przezroczystej folii (najlepiej Saran Wrap) na powierzchni transiluminatora UV lub — w przypadku stosowania lampy UV — na powierzchni czarnego papieru.

2.    Na rozciągniętą folię wprowadzić pipetą równe objętości szeregu próbek wzorcowych o stężeniu DNA 0, 1, 2,5; 5, 10 i 20 pg/ml oraz próbki lub prób badanych.

3.    Do każdej próbki dodać równą objętość buforu TE z bromkiem etydyny i wymieszać przez pipetowanie.

4.    W świetle UV dokonać porównania natężenia fluorescencji bromku etydyny badanych próbek z próbkami wzorcowymi i na tej podstawie określić zawartość DNA w roztworze.

Uwagi:

1)    Szereg wzorcowych roztworów DNA należy sporządzić z DNA o długości zbliżonej do długości badanego DNA.

2)    Bromek ctydyny jest silnym mutagenem oraz substancją toksyczną. (Poza normalnymi środkami ostrożności przewidzianymi dla substancji toksycznych, roztwory zawierające bromek etydyny i nic przewidywane do dalszego użycia należy poddać procedurze dekontaminacji, która (zależnie od stężenia roztworu) może przebiegać następująco:

a)    Roztwór o stężeniu bromku etydyny ponad 0,5 mg, ml (Quillardet i Hofnung 1988): dodać taką ilość H₂0, aby stężenie bromku etydyny było mniejsze od 0.5 mg/ml; wprowadzić 1 objętość KMn0₄; wymieszać i dodać 1 objętość 2,5 M HC1, pozostawić w temperaturze pokojowej przez 12 godz.; wlać równą objętość 2,5 M NaOH; po wymieszaniu można wylać do zlewu.

b)    Rozcieńczony roztwór bromku etydyny (np. bufor elektroforetyczny o stężeniu bromku ctydyny 0,5 pg/ml), (Bcnsaud, 1988): na każde 100 ml roztworu dodać 100 mg węgla aktywnego i pozostawić w temperaturze pokojowej na I godz., mieszając od czasu do czasu; przesączyć roztwór przez filtr; filtr i zużyty węgiel włożyć do zamykanej torby foliowej i jeżeli jest taka możliwość, oddać je do punktu przyjmowania materiałów' szkodliwych.

3)    Promieniowanie L V jest szkodliwe, szczególnie dla oczu, należy więc zachować środki ostrożności — osłony, okulary itd.

4)    Oceny natężenia fluorescencji opisanej w etapie 4. można dokonać wizualnie lub przez sporządzenie fotografii i analizę dcnsytometryczną zdjęć.

Ćwiczenie 10.35. Pomiar ilości DNA zmodyfikowaną metodą z difenyloaminą (G.J. Gendimenico i wsp. I988: Arial. Biochent., 173:45 48)

Zasada: Metoda ta opiera się na metodzie Burtona, wykorzystującej tworzenie barwnego roztworu powstającego w reakcji DNA (poddanego hydrolizie kwasowej) z difenyloaminą w' obecności kw'asu siarkowego, kwasu octowego i aldehydu

433