02

Ze względu na to, że dodanie NaOH do gorącej agarozy powoduje jej hydroliz topnienie agarozy przeprowadza się roztworze obojętnym (zazwyczaj w W₂0\ a bufor zasadowy dodaje się przed wylaniem żelu na płytkę.

Materiał: Roztwór DNA Odczynniki:

1)    Agaroza.

2)    10 M roztwór NaOH.

3)    0.5 M roztwór EDTA (pH 8,0).

4)    Bufor zasadowy do elektroforezy: 50 mM NaOH - 1 mM EDTA (pH 8,0).

5)    96% roztwór etanolu.

6)    Zasadowy bufor obciążający: 300 mM NaOH - 6 mM EDTA - 18% Ficoll, typ 400 - 0,15% zicl:ń bromokrezolowa - 0.25% cyjanian ksylenu.

7)    Bufor neutralizujący: 1 M Tris/HCl - 1,5 M NaCl (pH 7,6).

Aparatura: Aparat do elektroforezy z wyposażeniem, mikrowirówka.

Wykonanie:

Etapy: 1., 2. i 4. —jak w ćw. 10.37.

3. Ochłodzić roztwór agarozy do temp. 60°C oraz dodać NaOH (odcz. 2) i EDTA (odcz. 3) do końcowego stężenia odpowiednio 50 m.M i 1 mM.

5.    Dodać taką ilość zasadowego buforu do elektroforezy (odcz. 4), aby jego poziom przekraczał o ok. 1 mm poziom żelu.

6.    Wytrącić DNA z próbek 2 objętościami schłodzonego etanolu (odcz. 5) i odwirować (12000 x g przez 5 min). Wytrącony DNA rozpuścić w 10-30 gl bufoni elektroforetycznego (odcz. 4). Dodać 0,2 objętości zasadowego buforu obciążającego (odcz. 6), zmieszać przez krótkie wirowanie. Wprowadzić próbki do studzienek w żelu używając strzykawki lub pipety.

7.    Podłączyć elektrody do źródła prądu tak, aby DNA migrował w kierunku anody i tak ustalić napięcie, aby natężenie pola elektrycznego pomiędzy elektrodami wynosiło 0,2 V/cm. Prowadzić elektroforezę, aż barwnik buforu obciążającego (cyjanian ksylenu) osiągnie ²/j długości żelu. Odłączyć elektrody od źródła prądu.

8.    Płukać żel w buforze neutralizującym (odcz. 7) przez 45 min.

9.    Poddać żel analizie (najczęściej stosuje się autoradiografię).

Uwagi:

1)    Podczas elektroforezy w warunkach alkalicznych nie dodaje się do żelu bromku etydyny, gdyż barwnik ten nie wiąże się z DNA przy wysokiej wartości pH.

2)    Żele zasadowe nagrzewają się znacznie szybciej niż żele obojętne, wobec czego elektroforeza w żelach zasadowych powinna być prowadzona pod napięciem dającym natężenie poła elektrycznego mniejsze od 0,25 V/cm.

3)    Barwnik zasadowego buforu obciążającego, zieleń bromokrezolowa, szybko dyfunduje z żelu do buforu, wobec czego, po wprowadzeniu próbek, należy przykryć żel płytką szklaną. Zabieg taki zwiększa również przyleganie żelu do płytki do elektroforezy; jeśli brak płytki dociskającej, w buforze zasadowym, żel może stracić kontakt z płytką do elektroforezy.

442