5

probówek (1* - 12* > po 0.4 ml 62.5 m.M bursztynianu. Do 2 pozostałych probówek (próby zerowe 13 i 13") dodajemy 0.4 ml 0.25 M buforu fosforanowego. pH 7,4 Do wszystkich (26) probówek dodajemy po 0.2 ml 0.4 % IN I, Z każdego zestawu 12 probówek zawierających dwa różne stężenia bursztynianu (25mM lub 62.5 m.M) wydzielamy dwie próby (kontrolne -II. 12 oraz 11*. 12"). do których dodajemy 0.2 ml lbO; natomiast do pozostałych 10 prób pipclujcmy po 0.2 mi kwasumalonowcgo o wzrastającym stężeniu od 3.25 do 19.5 mM (w dwóch powtórzeniachV Do prób zerowych, nie zawierających bursztynianu dodajemy po 0.2 ml wody. Wszystkie próby wstawiamy do termostatu i37"C) i po 5 minutach preinkubacji rozpoczynamy reakcję dodając 0.2 ml 1% homogenatu. Reakcję przerywamy po 15 min. dodając do każdej próby 1.5 ml mieszaniny - octan etylu, etanol TC A i natychmiast dokładnie mieszamy.

Natężenie barwy powstającego INT-iómazanu mierzy my wobec prób zerowych przy /. = 470 nm.

Korzystając z podanego współczynnika (k = 1.95 wyrażone w umolach INT-formazanu na próbę) obliczyć ilość powstającego w ciągu 1 minuty l\T-formazanu. Wyliczyć wartość 1 v i sporządzić krzywa Dixona czyli wykres zależności 1 \ od stężenia malonianu (I). Określić typ inhibicji i wy liczyć wartość K,.

UWAGA !

Przed sporządzeniem wykresu należy obliczyć końcowe stężenie substratu i inhibitora w mieszaninach reakcyjnych.