42

również ostrożnie nanieść na kolumnę 1 ml wody w celu wmycia białka i soli do wnętrza żelu. Po wniknięciu i tej porcji czynność powtórzyć jeszcze raz. Następnie kolumnę nad żelem napełnić ostrożnie wodą i utrzymywać jej objętość na względnie stałym poziomie przez cały czas prowadzenia rozdziału. Po zebraniu pierwszych 5 ml podstawić kolejne wyskalbwane na 1 ml probówki, zbierając do nich następne frakcje po 1 ml. W sumie zebrać 20 frakcji, po czym zamknąć wylot kolumny za pomocą ściskacza.

3.    Oznaczanie zawartości białka w próbie wyjściowej i frakcjach wycieku z kolumny. W celu oznaczenia zawartości białka w roztworze wyjściowym należy przenieść dokładnie 2 ml tego roztworu do kolby miarowej na 50 ml, kolbę dopełnić wodą do kreski i dobrze wymieszać. Do 2 probówek pobrać po 1 ml roztworu, dodać po 5 ml odczynnika miedziowego (3 ), wymieszać i po upływie 10 min dodać, intensywnie wstrząsając probówkę, po 0,5 ml odczynnika Folina (4 ). Po 30 min mierzyć intensywność zabarwienia w kolorymetrze przy czerwonym filtrze (670 nm) w^robec próby kontrolnej (z w^rodą). Uzyskaną wartość absorbancji (A) przeliczyć na pg białka, wykorzystując w- tym celu krzywą w-zorcową (ew. wiasną, wykonaną na ćwiczeniu nr 2).

W celu oznaczenia zawartości białka w kolejnych frakcjach wycieku z kolumny należy pobrać mikropipetą po 0,1 ml z frakcji od 1 do 8 (w dw'óch powtórzeniach), uzupełnić w^rodą do 1 ml i postępować dalej jak podano przy oznaczeniu białka w próbie wyjściowej.

4.    Wykrywanie jonu amonowego. Do 15 probówek pobrać kolejno po 0,1 ml roztworu z frakcji od 6 do 20, do każdej dodać po 4,4 ml wody dejonizow^ranej i po 0,5 ml odczynnika Nesslera (2); całość dobrze wymieszać i obserwować intensywność wytworzonego pomarańczowego zabarwienia.

Opracowanie wyników

W sprawozdaniu należy podać wyniki pomiarów' stężenia białka w roztworze wyjścio-w^fym i w^r eluacie, obliczyć procent odzyskanego białka w stosunku do naniesionego na

kolumnę. Ponadto wskazać numery frakqi, w których pojawia się jon NHJ, osiąga maksimum i zanika, oraz obliczyć objętość zerowe kolumny na podstawie objętości potrzebnej do wyeluowenia maksymalnego stężenia białka.

Pytania

1.    Na jakiej zasadzie opiera się rozdział substanqi metodą chromatografii sita molekularnego?

2.    Jakie zastosowania w biochemii może mieć Sephadex?

3.    Jak zbudowany jest żel Sephadex?

4.    Od czego zależy zdolność rozdzielcza żelu Sephadex?

5.    W jaki sposób można się przekonać o skutkach rozdziału mieszaniny na kolumnie z

sefadeksu?

6.    W jakiej kolejności wy'pływają z kolumny wypełnionej żelem Sephadex G-25 i G-100 jon amonowy, peptyd protamina (2-3 kDa) i pepsyna (35 kDa)?