98

Ilość zredukowanego żelazieyjanku oblicza się z różnicy między wynikami miareczkowania prób: kontrolnej i pełnej. Stężenie enzymu i substiatu powinno być tak dobrane, aby nadmiar żelazicyjanku po zakończeniu reakq'i odpowiadał przynajmniej 3,5 ml 0,002-molo-wego tiosiarczanu sodowego. Natomiast zużycie substratu w czasie reakq'i nie powinno przekraczać 50% zawartości izomeru L-mleczanu w racemacie.

Część b ćwiczenia może być wykonana w dwóch układach:

1.    Dwóch studentów wyznacza stałą Michaelisa-Menten i każdy z nich oznacza aktywność enzymu (4 godz.).

2.    Indywidualnie studenci oznaczają aktywność enzymu i poziom białka (4 godz.).

Odczynniki i materiały

1.0,5-moiowy D,Ł-mleczan sodowy; 100 ml kwasu D^L-miekowego(90-proc.) zmieszać ze 100 ml wody i dodawać stopniowo 5-molowy wodorotlenek sodowy do zobojętnienia (zużywa się ok. 230 ml), sprawdzając odczyn roztworu przez zmieszanie na płytce kropli roztworu z kroplą fenoloftaleiny. Następnie roztwór ogrzać do 80°C i po schłodzeniu dodawać zasadę do uzyskania na płytce (jak wyżej) różowego zabarwienia (zużywa się ok. 3 ml). Następnego dnia sprawdzić pH w pehametrze i w razie potrzeby doprowadzić do 8,0 i uzupełnić do 21.

2.    0,05-molowy DJL-mleczan sodowy.

3.    Rozcieńczone roztwory' mleczanu do wyznaczania stałej K_m o zawartości: 1, 2, 4 i 6 pnaoli izomeru L-mleczanu w 1 mi. W celu przygotowania tych roztworów należy kolejno odmierzyć następujące objętości 0,5-molowego D,L-mieczanu: 4, 8, 16 i 24 ml i uzupełnić wodą do 1 litra.

4.    Zbuforowany roztwór żelazicyjanku potasowego: a) 5-proc. roztwór K^Fe^Njg], b) 0,05-molowy bufor tris, o pH 8,0; przed użyciem roztwory a i b zmieszać w stosunku 1:9.

5.    Mieszanina siarczanu cynkowego, kwasu solnego i jodku potasowego: a) 25 g siarczanu cynkowego i 120 g chlorku sodowego rozpuścić w wodzie i uzupełnić do 1 1, b) stężony kwas solny rozcieńczony wodą w stosunku 1:1, c) 10-proc. roztwór jodku potasowego; przed użyciem roztwory a, b i c zmieszać w stosunku 5:4:1 (przechowywać w butelce z oranżowego szkła, roztwór trwały przez kilka godzin).

6.    0,002-molowy mianowany tiosiarczan sodowy.

7.    0,25-proc. roztwór skrobi rozpuszczalnej.

8.    Odczynnik miedziowy — patrz ćwicz. 2, str. 20.

9.    Odczynnik Folina — patrz str. 131.

10.    Wyciąg z drożdży: świeże drożdże piekarskie rozkruszyć, ułożyć cienką warstwą i suszyć przez kilkanaście godzin w suszarce z przewiewem w temp. 37°C; można też użyć handlowych drożdży suszonych.

Autoliza: 300 g suszonych drożdży zmieszać z 600 ml 0,1-molowego buforu tris o pH 8, doidadnie wymieszać i przetrzymać przez 4,5 godziny w temp. 37°C, mieszając od czasu do czasu. Następnie dodać 1 litr tego samego buforu, wymieszać i trzymać w temperaturze pokojowej 15 min, po czym całość wirować 15 min przy 6000 obr./min. Płyn znad osadu zlać ostrożnie, uzyskuje się ok. 1 litra wyciągu.

87