112944

podczas powolnego zamrażania chelatuje metale białkowe, co przeciwdziała denaturacji białek oraz obniża temperaturę mrożenia, co przeciwdziała tworzeniu kryształów lodu. Z drugiej strony DMSO jest toksyczny dla komórek i niekiedy nie może być stosowany ze względu na zdolność do indukcji różnicowania komórek.

Dodatkowo, w celu zwiększenia przeżywałności komórek w czasie mrożenia, do medium mrożącego dodawana jest surowica. W przypadku komórek bardzo wrażliwych stężenie surowicy w medium mrożącym może wynosić nawet 95% v/v.

OH

glicerol    DMSO

Rozmrażanie powinno przebiegać możliwie jak najszybciej, przez ok. 3-5 minut. Szybkie rozmrażanie zapobiega mechanicznemu uszkodzeniu komórek związanemu ze zjawiskiem wtórnego rozrastania się kryształów lodu.

Mrożenie i długoterminowe przechowywanie linii komórkowej Hel,a

Medium do mrożenia: 90% v/v surowica (FBS) + 10% v/v DMSO,

Sposób mrożenia:

1.    Wymrożenie krioprobówek przeznaczonych do zamrażania,

2.    Przygotowanie zawiesiny komórek:

-    Wykonać trypsynizację komórek HeLa przeznaczonych do mrożenia,

-    Zinaktywować trypsynę,

-    Odseparować komórki przez wirowanie,

-    Osad komórkowy zawiesić w schłodzonej surowicy, w ilości równej połowie objętości końcowej, komórki umieścić w łaźni lodowej,

-    Do zawiesiny komórek dodać schłodzoną surowicę z 20% dodatkiem DMSO (DMSO w temperaturze pokojowej jest toksyczny dla komórek).

Ilość surowicy z DMSO jest równa objętości zawiesiny komórek.

3.    Zawiesinę komórek z krioprotektantem rozporcjować do krioprobówek.

4.    Krioprobówki ułożone w pudełku styropianowym umieścić w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 2 godziny,

5.    Przełożyć komórki do zamrażarki do głębokiego mrożenia do temperatury -80°C i inkubować przez kolejne 12-24 godzin,

6.    Umieścić komórki w naczyniu kriogenicznym w ciekłym azocie w temperaturze -196 °C