74658

RNA

Główne rodzaje RNA

-mRNA -1-5% komórkowego RNA -tRNA -około 20%

-rRNA - 75%

Metody izolacji RNA

1    Izolacja specyficznego RNA poprzez frakcjonowanie całego RNA komórki

2    bezpośrednia izolacja specyficznego RNA, ograniczona wyłącznie do komórek, które syntezują go do większej ilości

3    Izolacja poli (A)RNA

4    Izolacja RNA z polirybosomów

5    izolacja całkowitego RNA komórki, a następnie uzyskanie określonego RNA (cDNA) metodą PCR

Warunkiem uzyskanie dobrej jakości RNA jest szybkie i skuteczne zahamowanie działania rybonukleaz, które występują we wszystkich żywych komórkach i bardzo szybko degradują RNA. Do izolacji RNA wymagane jest przygotowanie sprzętu i odczynnika, powinny być przygotowane na wodzie do której wcześniej dodano DEPC (dityloprowęglan), któiy hamuje działanie rybonukleaz.

Etapy izolacji RNA liza komórek

inaktywacja rybonukleaz za pomocą fenozolu

dodanie chromoforu i wirowanie (RNA pozostaje w fazie górnej, a DNA i białka przechodzą do fazy dolnej)

Fazę górną zbiera się i po dodaniu izopropanolu oczyszcza np. na złożu krzemionkowym (RNA osiada na złożu, a zanieczyszczenia przez nie przechodzą) rozpuszczenie oczyszczonego RNA w wodzie (do RNaz)